MtDNA SNPs復(fù)合檢測(cè)體系建立及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究.pdf

1、生物性檢材易受外來(lái)環(huán)境等因素干擾,一直是困擾法醫(yī)生物痕跡學(xué)專(zhuān)家們的難點(diǎn)問(wèn)題,如腐敗組織、陳舊骨骼等,因檢材的降解,使DNA序列的完整性受到破壞,影響鑒定結(jié)論的得出。目前國(guó)內(nèi)外法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最為廣泛的STR檢測(cè)系統(tǒng),通常適用于常規(guī)檢材,但對(duì)微量DNA檢材、降解檢材、無(wú)核檢材等則常常因等位基因丟失、非特異性擴(kuò)增、或擴(kuò)增不出檢測(cè)片段,導(dǎo)致檢測(cè)失敗,至今法醫(yī)生物痕跡學(xué)(法醫(yī)物證)領(lǐng)域尚未完全解決這一難題。
　　 人類(lèi)線粒體DNA(mi

2、tochondrial DNA,mtDNA)是位于細(xì)胞核以外的唯一基因組DNA,主要遵循母系遺傳,母親和子女、兄弟姐妹之間的mtDNA在理論上是一致的,個(gè)體唯一的mtDNA不存在。mtDNA是由一萬(wàn)六千多個(gè)堿基對(duì)組成的環(huán)狀閉合共價(jià)雙鏈分子,外有被膜包圍,這樣的特性使其在外界環(huán)境中不易受到核酸外切酶的影響。每個(gè)細(xì)胞核DNA只有兩個(gè)拷貝,而每個(gè)細(xì)胞的mtDNA有成千上萬(wàn)個(gè)拷貝,突變率是核DNA的5～10倍,但在外界環(huán)境中更易保存下來(lái),擴(kuò)增時(shí)

3、拷貝數(shù)更高,對(duì)于考古、大型災(zāi)難調(diào)查、親緣關(guān)系認(rèn)定、核DNA分型失敗的法醫(yī)學(xué)檢材等,mtDNA遺傳標(biāo)記具有良好的應(yīng)用前景。
　　 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是由基因組水平上的單個(gè)核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性,其中最少的一種在群體中的頻率不少于1％,具有在基因組分布廣泛、遺傳穩(wěn)定、分析易于自動(dòng)化等特點(diǎn)。它包括了人類(lèi)基因組已知多態(tài)性的80％,是最常見(jiàn)的遺傳變異類(lèi)型。

4、從生物遺傳和變異的本質(zhì)分析,SNPs將是一種最能反映群體遺傳結(jié)構(gòu)和個(gè)體間遺傳差異的標(biāo)記系統(tǒng)。由于具有分析片段更小(45-150bp)、遺傳穩(wěn)定,以及可實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化檢測(cè)等特點(diǎn),SNPs已經(jīng)成為法醫(yī)學(xué)解決高度腐敗檢材DNA分型以及其他領(lǐng)域的研究的熱點(diǎn)。在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用SNPs的主要目的是進(jìn)行大量SNPs位點(diǎn)的同步檢測(cè),累計(jì)多個(gè)SNPs位點(diǎn)的分型結(jié)果,認(rèn)定同一性或親權(quán)關(guān)系,從而在個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定中發(fā)揮作用。
　　 由于mtDNA具

5、有突變率高、母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組、進(jìn)化速度快等特性,很多研究主要是集中在mtDNA疾病、表觀遺傳學(xué)等方面。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)線粒體SNPs這一熱點(diǎn)領(lǐng)域已經(jīng)有了很多研究,但大多數(shù)針對(duì)人類(lèi)進(jìn)化、基因突變和表達(dá)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、表觀遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)和其他疾病如Parkinson's disease、Alzheimer's disease、肥胖、糖尿病等方面進(jìn)行研究,進(jìn)行高通量的研究比較少。雖然也有在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的研究,但還沒(méi)有針對(duì)中國(guó)人群已經(jīng)建

6、立的復(fù)合高效檢測(cè)遺傳標(biāo)記體系的研究。本課題利用復(fù)合PCR擴(kuò)增、熒光標(biāo)記單堿基延伸(SBE)技術(shù)和毛細(xì)電泳檢測(cè)相結(jié)合的方法,建立一個(gè)多位點(diǎn)的mtDNA SNPs復(fù)合檢測(cè)體系,實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)mtDNA SNPs位點(diǎn)同步快速擴(kuò)增,建立的體系特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高,為微量、降解檢材和無(wú)核檢材的高通量分型提供了新的技術(shù)手段和方法,并通過(guò)廣東地區(qū)人群的群體遺傳學(xué)調(diào)查,探討其在法醫(yī)學(xué)案件中的應(yīng)用價(jià)值。
　　 根據(jù)NCBI的dbSN

7、Ps數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/dbSnp)、核酸數(shù)據(jù)庫(kù)查找到rCRS(修正劍橋參考序列,Revised Cambridge ReferenceSequence),從mitoMAP數(shù)據(jù)庫(kù)(A human mitochondrial genome database)、mtDB數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Mitochondrial Genome Database)報(bào)道在亞洲人群中多態(tài)性較好、側(cè)翼序列穩(wěn)

8、定的mtDNA SNPs位點(diǎn)和部分從未用于亞洲人群檢測(cè)位點(diǎn),其選擇目的在于研究在中國(guó)人群是否存在多態(tài)性,其選擇的位點(diǎn)包括8392、5178、8414、10211、14470、13626、15217、709、1719、15607、13928、7028、10398、10400、6392、9090、5843、2092、16519、4833、5250、12438、4529、4580、11719、477、4793、11914、12633、1285

9、8、10873、13263、7202。
　　 根據(jù)上述位點(diǎn)進(jìn)行普通PCR引物設(shè)計(jì)和單個(gè)SNPs位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增,利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(nPAGE)和銀染技術(shù)對(duì)單位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。其后通過(guò)“加尾”設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的單堿基延伸引物(單堿基引物的長(zhǎng)度為18-88nt,每個(gè)位點(diǎn)只設(shè)計(jì)一條引物),利用SNaPshotTM Multiplex Kit試劑盒對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)及毛細(xì)管電泳檢測(cè),確定各個(gè)位點(diǎn)的遷移距離

10、。通過(guò)正交法對(duì)復(fù)合PCR體系中各組分及PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整,去除無(wú)法進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增的位點(diǎn)如2092、6392、9090、5843,引物間二聚體形成的位點(diǎn)如8392,無(wú)法用復(fù)合單堿基延伸方法檢測(cè)的位點(diǎn)如10400、8414、5178、10211,有非特異性擴(kuò)增位點(diǎn)如13626、15217、14470,考慮引物間的相互作用和擴(kuò)增效率,在保證體系的高多態(tài)性的情況下,綜合考慮了引物間的相互作用、體系穩(wěn)定性和擴(kuò)增檢測(cè)效率,最終選定了2

11、1個(gè)mtDNA SNPs位點(diǎn),建立復(fù)合檢測(cè)體系。
　　 最后使用建立的體系對(duì)236名廣東地區(qū)無(wú)關(guān)個(gè)體、30個(gè)三聯(lián)體家系進(jìn)行調(diào)查,并對(duì)實(shí)際檢案中收集的部分微量、腐敗降解檢材進(jìn)行檢測(cè)分型,評(píng)估該體系在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值,最終獲得了21個(gè)mtDNA SNPs位點(diǎn)的頻率分布資料,除位點(diǎn)12438、477外,其余19個(gè)遺傳標(biāo)記位點(diǎn)在廣東地區(qū)人群中均具有遺傳多態(tài)性。去除12438、477兩個(gè)位點(diǎn),最終建立19個(gè)mtDNA-SNPs復(fù)合檢測(cè)體

12、系,其基因多樣性(gene diversity)GD范圍為0.0085-0.4980,共檢測(cè)到90種單倍型(haplotype),單倍型多樣性(haplotype diversity)HD為0.9705。
　　 在建立的10μl PCR復(fù)合擴(kuò)增體系中,最低檢測(cè)量為50pg,當(dāng)模板量在0.1～10ng時(shí),能得到較理想結(jié)果。檢測(cè)10種動(dòng)物血樣,猴、牛、豬、鵝、鼠、兔、雞、羊、狗、貓的DNA樣本均無(wú)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。本課題研究中同一個(gè)體

13、的肌肉、皮膚、肝臟、脾臟、毛發(fā)、指甲、軟骨、血痕和骨骼等組織基因分型沒(méi)有差異性。
　　 本體系采用檢測(cè)30例家系(外祖母-母-子/女)、20對(duì)兄弟和姐妹、5個(gè)同一母系來(lái)源的表姐妹,未發(fā)現(xiàn)有突變,個(gè)體分型結(jié)果一致。
　　 對(duì)實(shí)際檢案中收集的部分微量、腐敗檢材進(jìn)行檢測(cè)分型,對(duì)于50例STR僅檢出1～5個(gè)基因座的檢材,本體系能夠成功完成18個(gè)mtDNA SNPs以上位點(diǎn)的分型。
　　 結(jié)論:本課題研究建立了一個(gè)以單堿基

14、延伸和毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)的19-plex mtDNA SNPs復(fù)合檢測(cè)體系,包括709、1719、15607、13928、7028、10398、16519、4833、5250、4529、4580、7202、11719、4793、11914、12633、12858、10873、13263。該體系在中國(guó)廣東地區(qū)漢族人群中具有多態(tài)性,遺傳穩(wěn)定性好、種屬特異性強(qiáng)。所建立的19個(gè)mtDNA SNPs復(fù)合檢測(cè)體系靈敏度高、通量大、重復(fù)性好