小分子VLDL-R結(jié)合功能片段克隆、原核表達(dá)及多抗制備.pdf

1、動(dòng)脈硬化(As)是威脅人類健康和生命的主要疾病之一，它與脂蛋白代謝異常密切相關(guān)，而脂蛋白受體在血脂代謝中起關(guān)健的作用。 受體與配體的識(shí)別、結(jié)合是受體發(fā)揮生理功能的重要基礎(chǔ)。極低密度脂蛋白受體(VLDL-R)是低密度脂蛋白受體超家族的成員，廣泛參與脂質(zhì)代謝、細(xì)胞遷移及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。VLDL-R的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域上含有8個(gè)富含半胱氨酸的重復(fù)序列（ligand binding repeats,LBR），被認(rèn)為是與配體結(jié)合的部位。近來的

2、研究進(jìn)一步提示VLDL-R的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中LBR1-3含有與配體識(shí)別、結(jié)合的關(guān)健位點(diǎn)。本研究的目的是用基因工程手段云獲得小分子VLDL受體片段并將融合蛋白免疫新西蘭兔以獲得相應(yīng)多克隆抗體，為進(jìn)一步研究受體的功能奠定基礎(chǔ)。 在實(shí)驗(yàn)中，我們以全長(zhǎng)VLDL-R　cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增獲得LBR1-3和1-8的DNA片段并將其分別克隆至Pet-28a(+),CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3),利用IPTG誘導(dǎo)蛋

3、白表達(dá)并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，利用載體pET-28a(+)上的6個(gè)His標(biāo)簽使得表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni+-NTA親和層析樹脂純化并由Western Blot驗(yàn)證。將純化的融合蛋白LBR1-3和LBR 1-8免疫新西蘭兔，制備抗血清并用間接ELISA方法檢測(cè)抗血清的效價(jià)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示首先成功克隆了LBR1-3和LBR 1-8的DNA片段，其次構(gòu)建了pET-28a(+)-LBR1-3和pET-28a(+)-LBR 1-8重組質(zhì)粒，并在大甩

4、桿菌Rosetta(DE3)中得以表達(dá)并確定了最侍條件即：LBR1-3在IPTG濃度0.4mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間16h,誘導(dǎo)溫度30℃的條件下，表達(dá)量最高；而LBR1-8在IPTG濃度0.6 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間4 h，誘導(dǎo)溫度30℃的條件下，表達(dá)量最高。融合蛋白LBR1-3和LBR1-8經(jīng)Ni+-NTA親和層析樹脂得以純化并制備了其多克隆抗體，間接ELISA方法檢測(cè)效價(jià)分別為為1：10000和1：100000。 本研究通過