抗性浸礦細(xì)菌的選育及抗性機(jī)理研究.pdf

1、本研究選育對(duì)重金屬等毒性離子具有抗性的高效浸礦菌株，并對(duì)抗性菌株對(duì)重金屬等毒性離子的耐受能力、耐受機(jī)理、抗性相關(guān)基因及基因差異表達(dá)、陰離子對(duì)細(xì)菌的影響等進(jìn)行研究。用9K培養(yǎng)基分別以Fe<'2+>及元素S作為能源，對(duì)來(lái)自江西德興銅礦、湖北大冶銅礦、廣西大廠等多個(gè)礦區(qū)的礦坑水樣本進(jìn)行了硫化礦浸礦細(xì)菌的富集、篩選、馴化、分離純化，得到能氧化Fe<'2+>及元素S的純化菌株。提取純化細(xì)菌基因組DNA，通過(guò)PCR聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出其16S rDN

2、A片段，測(cè)定其16S rDNA片段的核苷酸序列，用BLASTX寸其16S rDNA序列進(jìn)行比較分析以鑒定選育出的浸礦細(xì)菌并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。在9K培養(yǎng)基中分別加入Cu<'2+>，Ag<'+>，Hg<'2+>，pb<'2+>，Mg<'2+>等重金屬離子，通過(guò)重鉻酸鉀滴定法測(cè)定培養(yǎng)基中的：Fe<'2+>濃度來(lái)確定所分離的菌株在重金屬離子抑制情況下對(duì)Fe<'2+>的氧化能力變化并篩選出重金屬抗性菌株。對(duì)抗性菌株的最高耐受能力進(jìn)行測(cè)定并在最高耐受濃度

3、時(shí)對(duì)Fe<'2+>的氧化能力進(jìn)行測(cè)定和分析。對(duì)篩選出的重金屬抗性菌株進(jìn)行紫外誘變以獲得具有更高的Fe<'2+>氧化能力及更高重金屬離子耐受能力的突變菌株。根據(jù)GenBank中的抗性基因序列白行設(shè)計(jì)抗性基因引物，對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的重金屬抗性基因(抗銅基因、抗砷基因及抗銀基因)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、分子克隆及序列測(cè)定，用BLAST搜索工具對(duì)上述抗性基因進(jìn)行分析；對(duì)上述抗性基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。在不同銅離子濃度時(shí)對(duì)抗銅基因差異表達(dá)進(jìn)行分析

4、并進(jìn)行銅藍(lán)浸礦實(shí)驗(yàn)。在以Fe<'2+>為能源的9K培養(yǎng)基中加入不同鋅鹽，研究在同種陽(yáng)離子存在時(shí)陰離子對(duì)浸礦菌株的Fe<'2+>氧化能力的影響。 16S rDNA的序列分析結(jié)果表明，本研究的實(shí)驗(yàn)菌株均為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，簡(jiǎn)稱為At.ferrooxidans)。實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)重金屬離子的耐受能力測(cè)定結(jié)果表明，馴化后篩選出對(duì)重金屬離子有較高抗性的抗性菌株，對(duì)Cu<'2+>，A

5、g<'+>，Hg<'2+>，Pb<'2+>，Mg<'2+>的最高耐受能力分別為32000 mg/L，240 mg/L，0.9 mg/L，3500 mg/L，22500 mg/L。而野生菌株對(duì)上述離子的最高耐受濃度分別為19000mg/L，60 mg/L，0.1 mg/L，400 mg/L，13500 mg/L，說(shuō)明馴化后抗性菌株對(duì)重金屬離子的耐受能力明顯增強(qiáng)。對(duì)具有較高Cu<'2+>抗性和Ag<'+>抗性的抗性菌株進(jìn)行紫外誘變，獲得的突

6、變菌株生長(zhǎng)性能穩(wěn)定，比誘變前菌株及野生菌株具有更高的Fe<'2+>氧化能力和更強(qiáng)的耐受重金屬離子性能。其對(duì)Cu<'2+>和Ag<'+>的耐受能力分別是野生菌的2-3倍，是馴化菌的1.1-1.3倍。對(duì)其抗銅機(jī)理及抗銀機(jī)理研究的結(jié)果表明： At.ferrooxidans有抗銅基因AFE0454 copper resistance protein；但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)抗銀基因silC。在不同銅離子濃度時(shí)抗銅基因表達(dá)有明顯差異。銅藍(lán)浸礦實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)M26<'

7、＃>的浸礦能力明顯高于DC<'＃>和26<'＃>，在CuS濃度為9％時(shí)M26<'＃>浸出率可達(dá)66.87％。對(duì)抗銅基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)域CopD和PcoD。結(jié)構(gòu)域CopD編碼抗銅蛋白，而PcoD的預(yù)測(cè)產(chǎn)物是銅離子導(dǎo)出蛋白。PcoD與CopD均與Cu<'2+>抗性有關(guān)。通過(guò)自行設(shè)計(jì)的抗砷基因引物對(duì)另一個(gè)抗性基因抗砷基因arsH進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)菌株的抗砷基因arsH的序列與模式菌株At. ferroo

8、xidansATCC23270的序列有14個(gè)堿基不同。對(duì)arsH基因編碼的arsH蛋白進(jìn)行分析，找到了一段以硫作為信號(hào)的NADPH(還原性輔酶Ⅱ)依賴的FMN(黃素單核苷酸)還原酶的功能域。推測(cè)At.ferrooxidans菌中arsH的功能可能與arsC基因編碼的還原酶的氧化還原作用有關(guān)。 除了重金屬離子At. ferrooxidans菌的影響，陰離子對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)活性及Fe<'2+>氧化能力也有重要影響，其影響的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篠O