以p33融合蛋白為抗原建立牛瑟氏泰勒蟲病間接ELISA診斷方法.pdf

1、牛瑟氏泰勒蟲(T.sergenti)p33蛋白是T.sergenti主要蟲體表面蛋白之一，具有很好的反應(yīng)原性和免疫原性。本試驗(yàn)應(yīng)用的抗原是在E.coliDH5α表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)的韓國(guó)株T.sergenti(韓國(guó)株與中國(guó)株的T.sergenti氨基酸序列的同源性為99.6％)p33融合蛋白。經(jīng)Westernblot分析，韓國(guó)株T.sergenti的p33蛋白和p33融合蛋白與中國(guó)牛血清中T.sergentip33抗體具有良好的特異性反應(yīng)，

2、而空表達(dá)載體MBP蛋白則不能。因此，韓國(guó)株T.sergentip33融合蛋白可以用于檢測(cè)中國(guó)株T.sergentip33抗體間接ELISA方法的診斷抗原。 對(duì)間接ELISA的反應(yīng)條件進(jìn)行了摸索，確定了最適工作條件。結(jié)果表明，Nunc公司生產(chǎn)的酶標(biāo)板的變異系數(shù)為4.2％，達(dá)到間接ELISA的要求；p33融合蛋白抗原最適包被濃度為1.5μg/ml，最適包被條件為4℃12h；待檢血清的最適稀釋度為1：100，酶標(biāo)二抗的最適工作濃度為

3、1：4000，血清與酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時(shí)間均為4℃1h；選用3％脫脂乳作為酶標(biāo)板的最適封閉液，最適封閉時(shí)間為37℃1h；PBST稀釋液中脫脂乳蛋白穩(wěn)定劑的濃度為3％；底物最適反應(yīng)條件為室溫25min；陰陽性臨界值為0.35。經(jīng)阻斷試驗(yàn)、交叉反應(yīng)試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)，表明建立的間接ELISA方法是特異的，且重復(fù)性好；與乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)進(jìn)行比較，陰性符合率為90.0％，陽性符合率為100％，總符合率為96.7％，P＞0.05，說明兩種檢測(cè)方法

4、無顯著性差異；對(duì)采集于延邊州牛瑟氏泰勒蟲病流行地區(qū)的琿春市、敦化市的104份牛血清樣品進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果琿春市56份牛血清樣品的T.sergenti陽性率為73.2％；敦化市48份牛血清樣品的T.sergenti陽性率為60.4％。 本試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用韓國(guó)株T.sergentip33融合蛋白為抗原，成功建立了一種檢測(cè)中國(guó)牛血清中T.sergentip33抗體的間接ELISA診斷方法，為我國(guó)牛瑟氏泰勒蟲病的免疫監(jiān)測(cè)和