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1、嗜熱液化芽孢桿菌(Bacillus thermoliquefaciens-NL)產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性,工業(yè)應(yīng)用潛力大.本研究克隆了嗜熱液化芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶基因,對基因進行定向進化,選用不同的表達系統(tǒng)對不同的重組酶基因進行表達.主要研究結(jié)果如下: 1、通過對不同來源的內(nèi)切葡聚糖酶基因的同源序列比對,選擇高度保守區(qū)域設(shè)計引物,克隆了嗜熱液化芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5A.測序表明,其長度為1,500 bp,編
2、碼499個氨基酸,N端起始的29個氨基酸為信號肽序列,其全長理論分子質(zhì)量為55.2kDa.該基因和已報道的桿菌纖維素酶序列具有很高的同源性,如與Bacillus Subtilis. PAP115(Z29076)、B. subtilis.CK-2(X67044)的DNA序列同源性分別為99.8％、99.73％,所編碼蛋白同源性分別達到99.6％、99.4％,已公布基因中的Glu490,Thr496分別被Arg和Ala所代替. 2、
3、將內(nèi)切葡聚糖酶基因全序列(Cel5A Ⅰ)和成熟肽序列(Cel5A Ⅱ)分別定向插入到原核表達載體pET-20b上,得到重組質(zhì)粒pET-20b-Cel5A Ⅰ和pET-20b-Cel5A Ⅱ,均在大腸桿菌BL21 CodonPlus(DE3)-RIL中得以表達,單位發(fā)酵液的酶活力分別為0.0238U/ml和0.0242U/ml,SDS-PAGE分析表明Cel5A Ⅱ的表達量有所提高,但大部分表達蛋白為無活性的包涵體. 3、構(gòu)建重
4、組質(zhì)粒pPICZαB-Cel5A Ⅱ并電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115獲得基因工程菌GS115Cel5A Ⅱ,篩選得到的重組菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)后,上清液的發(fā)酵活力最高為0.089U/ml,是大腸桿菌表達量的3.7倍. 4、根據(jù)其氨基酸序列以及畢赤酵母偏愛密碼子,人工設(shè)計并通過重疊延伸PCR法合成內(nèi)切葡聚糖酶成熟肽基因(Cel5AⅢ),長為1,427bp.構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαB-Cel5AⅢ并電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115獲得基因工程菌GS1
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