擬南芥菜基因Arabidillo-1結(jié)構(gòu)和功能的初步研究.pdf

1、本文的主要內(nèi)容是對擬南芥基因加Arabidillo-1進(jìn)行的初步研究。我們首先從已公布的擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫中獲得了Arabidillo-1的相關(guān)信息，并對該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)相關(guān)的初步分析。該基因長4044bp，mRNA全長2793bp，表達(dá)產(chǎn)物包含930個(gè)氨基酸，該蛋白在N端包含一個(gè)F-box結(jié)構(gòu)域，另外該蛋白還含有多個(gè)Arm結(jié)構(gòu)域。然后本文從擬南芥中將Arabidillo-1克隆了出來，并通過測序確認(rèn)了該基因的全序列，同時(shí)將該基因

2、的cDNA克隆到T-載體中，作為后面的實(shí)驗(yàn)中Arabidillo-1的模板。 本文將ARABIDILLO-1的cDNA與熒光蛋白YFP的基因分別插入植物雙元表達(dá)載體pKYL71中，然后分別利用花序法和葉盤法轉(zhuǎn)化南芥和煙草。通過對轉(zhuǎn)基因植物材料的觀察，發(fā)現(xiàn)ARABTDILLO-1蛋白定位在細(xì)胞核上。然后我們又克隆了Arabidillo-1的上游啟動子，并將其插入植物表達(dá)載體pBI121中與GUS基因相連，花序法轉(zhuǎn)化擬南芥后，通過G

3、US染色初步發(fā)現(xiàn)該蛋白在擬南芥的根，頂端分生組織和子葉中有表達(dá)。此外本文還用RT-PCR的方法進(jìn)一步對ARABIDILLO-1的組織定位進(jìn)行了研究，試驗(yàn)表明該蛋白在擬南芥的根，莖，葉，花中都有表達(dá)，而且在根和花中表達(dá)最多。同時(shí)我們購買了針對該基因T-DNA插入失活的擬南芥突變體，通過對該突變體的初步研究，發(fā)現(xiàn)該蛋白在GA3處理下對擬南芥?zhèn)雀陌l(fā)育有影響，而KT，6-BA，IAA，2，4-D處理對突變體和野生型的影響都沒有明顯區(qū)別。此外，

4、我們還分別用高鹽(高濃度NaCl)及Ca<'2+>阻斷劑異博定(Verapamil)處理突變體和野生型擬南芥，也沒有發(fā)現(xiàn)突變體與野生型的表型區(qū)別。 本文將ARABIDILLO-1的cDNA的全長插入到含有BD(binding domain)結(jié)構(gòu)域酵母雙雜載體pGBKT7中，與已構(gòu)建到含有AD(active domain)結(jié)構(gòu)域的酵母雙雜載體pGADT7中的ASK家族共十七個(gè)成員分別進(jìn)行酵母雙雜交，結(jié)果顯示ARABIDILLO-1

5、與ASK2和ASK11酵母雙雜結(jié)果呈陽性，表明它們之間存在蛋白間相互作用。在此基礎(chǔ)上，我們又將ARABIDILLO-1分為不同的九個(gè)片段，分別與ASK2和ASK11進(jìn)行雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASK2和含有F-box結(jié)構(gòu)域的所有ARABIDILLO-1的片段都存在相互作用，而ASK11則只與僅缺少C端的ARABIDILLO-1的大片斷(包含1-750個(gè)氨基酸)存在相互作用，而與其余片斷都不存在相互作用。除此之外，本文還發(fā)現(xiàn)ARABIDILLO-1

6、的同源物ARABIDILLO-2只與ASK2存在相互作用，而與包括ASK11在內(nèi)的其它16個(gè)ASK家族成員都不存在相互作用。ARABIDILLO-1不能形成二聚體，而且ARABIDILLO-1和ARABIDILLO-2不能形成異源二聚體。 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測，ARABIDILLO-1對側(cè)根發(fā)育的影響是通過將某些抑制側(cè)根發(fā)育的蛋白因子連接到泛素連接酶E3上，進(jìn)而促使這些蛋白因子的泛素化降解而實(shí)現(xiàn)的。由于ARABIDILLO-1定為