大菱鲆受哈維氏弧菌感染后的基因差異表達研究.pdf

1、大菱鲆是一種非常名貴的海洋魚種，它生長迅速并且味道十分鮮美，從而深受人們的喜愛。然而，目前魚類的病害問題已成為限制海水魚類養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素，其中哈維氏弧菌是海水養(yǎng)殖動物(魚、蝦)的重要致病菌，給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。 為解決養(yǎng)殖魚的病害問題，增強養(yǎng)殖種類的抗病力，必須對病原菌和魚類免疫系統(tǒng)之間的相互作用關系有全面的了解。然而，魚類的許多免疫/抗病相關基因尚不清楚。由于大多數(shù)免疫/抗病相關基因并非組成型表達，而

2、是受病原物感染影響的誘導型表達，因此如能分析免疫細胞基因在病原物感染時的差異表達，就有可能發(fā)現(xiàn)和鑒別新的免疫/抗病相關基因，并在分子水平上闡明免疫細胞和病原菌之間的相互作用關系。 抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)技術是Diatchenko等以mRNA差別顯示技術為基礎建立起來的篩選未知的差異表達基因的新技術，它主要基于抑制PCR，并結合標準化(normalizat

3、ion)和消減雜交(subtractive hybridization，SH)技術。它克服了mRNA差異顯示技術的假陽性高和代表性差別分析法的消減雜交輪次較多的缺點，十分適用于分析造成某種特殊表性的目的基因及其功能，從而成為差異表達基因篩選最有潛力的新方法。 本文運用SSH技術比較了經(jīng)哈維氏弧菌感染的和未受感染的大菱鲆差異表達基因。利用Trizol試劑分別從對照組和實驗組中提取腎組織和脾組織的總RNA，將同一組的總RNA混合并分

4、離、純化mRNA，構建雙向SSH差減文庫，克隆差減片斷，對陽性克隆片斷測序分析及GetiBank同源性檢索。共鑒定出49個差異片段，通過與GenBank數(shù)據(jù)庫的比對，發(fā)現(xiàn)這些基因片段大部分為免疫相關基因，包括主要組織相容性復合體基因、熱激蛋白基因、信號蛋白基因等。其中，一個差異片段被證實為主要組織相容性復合體MHC class I a基因(登陸號EF032639)，通過RACE技術獲得其全長的cDNA，測序并分析其編碼產(chǎn)物的性質。該基因

5、序列全長1466bp，包含一個1062 bp的開放閱讀框，編碼354個氨基酸。5’UTR長127 bp，3’UTR長277 bp，并且在3’UTR區(qū)poly-A尾1185 bp處含有一多聚腺苷酸信號序列ATTAAA。經(jīng)比對后發(fā)現(xiàn)，MHC class Ia氨基酸序列與牙鲆、青鳉魚、虹鱒、大西洋真鱈、紅鰭東方純、雞、鼠、和人的同源性分別為68％，54％，51％，52％，57％，33％，29％，29％。熒光實時定量PCR技術是指在PCR反應體

6、系中加入熒光基團，利用熒光信號累積來檢測PCR產(chǎn)物。實時熒光定量PCR技術通過檢測PCR產(chǎn)物中熒光訊號強度來達到定量的目的，該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。本文采用了SYBR Green I熒光染料，通過相對定量中的雙標準曲線法，以大菱鲆看家基因β-actin為內(nèi)參進行校正，比較了經(jīng)哈維氏弧菌感染的和未受感染的大菱鲆中MHC class Ia基