玫瑰黃鏈霉菌幾丁質(zhì)酶基因及抗生素合成基因簇研究.pdf

1、鏈霉菌是一種廣泛分布于土壤中的革蘭氏陽性菌，是重要的天然抗生素和幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌。幾丁質(zhì)酶可通過催化幾丁質(zhì)的水解，破壞植物病原真菌細(xì)胞壁的主要組分，從而起到抑制植物病害發(fā)展的作用。本研究應(yīng)用平板稀釋法從棉花根圍土壤樣品中分離到了360株鏈霉菌，采用雙層平板法測定它們對棉花黃萎病菌生長的抑制作用。此外還對本實(shí)驗(yàn)室保存的24株生防鏈霉菌進(jìn)行了抑菌活性測定，這24株生防鏈霉菌對棉花黃萎菌都表現(xiàn)出很好的抑菌效果。 對表現(xiàn)抑菌活性的185

2、株拮抗鏈霉菌菌株使用透明圈法測定，發(fā)現(xiàn)其中115株有幾丁質(zhì)酶活性。采用水煮法、STE法、SDS法、微波法等4種方法提取鏈霉菌的DNA，并以鏈霉菌16SrDNA引物來擴(kuò)增提取到的DNA。結(jié)果表明除STE法外，其他3種方法所提樣品都能擴(kuò)增出預(yù)想的約1.6Kb的片段，且利用水煮法可以更快速、有效的提取出適用于PCR分子探測的鏈霉菌DNA。 從GenBank中檢索到26個鏈霉菌幾丁質(zhì)酶基因序列，根據(jù)保守序列，設(shè)計了兩對PCR引物(Ch

3、i-1/Chi-2和Chi-3/Chi-4)。對115株有幾丁質(zhì)酶活性的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有112株可以擴(kuò)增出預(yù)期的特異片段。其中48株菌株對兩對引物都有擴(kuò)增產(chǎn)物，92株對Chi-1/Chi-2引物有產(chǎn)物，68株對Chi-3/Chi-4引物有產(chǎn)物。分別選擇兩菌株的兩對引物組合的擴(kuò)增產(chǎn)物測序，BLAST比較發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)物與其對應(yīng)的幾丁質(zhì)酶基因類型一致，從而證明了兩對引物的可靠性，建立了一套可以快速鑒定幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的PCR探測方法。

4、 Men-myco-93-63菌株是從馬鈴薯瘡痂病自然衰退土壤中分離得到鏈霉菌菌株，經(jīng)鑒定為玫瑰黃鏈霉菌。該菌及其次生代謝產(chǎn)物對不同致病力的棉花黃萎病菌及其它多種植物病原菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了該菌株生防相關(guān)基因克隆的研究： 1.克隆了Men-men-93-63幾丁質(zhì)酶基因C的催化域區(qū)域；PCR擴(kuò)增得到包含信號肽區(qū)、纖維素結(jié)合區(qū)、幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)三個結(jié)構(gòu)功能域的變鉛青鏈霉菌幾丁質(zhì)酶C(S.liv

5、idansChiC)基因片段，此片段與催化域部分、質(zhì)粒pET23b(+)連接，構(gòu)建成表達(dá)載體pLCH轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)后在幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基上表現(xiàn)幾丁質(zhì)酶蛋白活性。 2.利用pKC505柯斯質(zhì)粒建立了玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的柯斯質(zhì)粒文庫，提取文庫中克隆的質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到S.lividans中。以棉花黃萎病菌作為指示菌，篩選可以抑制黃萎病菌生長的轉(zhuǎn)化子，未篩選到陽性克隆。 3.根據(jù)聚酮合成酶類(P

6、KS)、氨基糖苷類(STR)和非核糖體含硫多肽類(NRPS)抗生素合成基因簇中的保守序列設(shè)計引物，對Men-myco-93-63基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，PKS引物得到了約500bp片段，而STR引物得到750bp的片段。經(jīng)測序和Blast比較發(fā)現(xiàn)：其序列與預(yù)期的片段沒有相似性，其是否與抗生素合成相關(guān)還需要進(jìn)行基因阻斷試驗(yàn)來驗(yàn)證。 4.對Men-myco-93-63含有的抗性基因進(jìn)行探測，通過抗生素抗性基因PCR引物，對M

7、en-myco-93-63進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該菌株含有β-內(nèi)酰胺酶基因，對氨芐青霉素具有抗性，使用氨芐青霉素對其進(jìn)行了驗(yàn)證。利用pKC1139質(zhì)粒構(gòu)建了Men-myco-93-63菌株的質(zhì)粒文庫，利用PCR引物篩選文庫，篩選到兩個陽性克隆，分別測序發(fā)現(xiàn)插入片段都包含有完整的β-內(nèi)酰胺酶基因。對片斷中的內(nèi)酰胺酶基因的兩端序列ORF進(jìn)行Blast分析，在GenBank中未發(fā)現(xiàn)相似的蛋白序列，這兩個片段是否與抗生素合成相關(guān)還需要進(jìn)行基因阻斷來驗(yàn)證