白念珠菌高鐵還原酶FRP1基因及其與Rim101蛋白相互作用的研究.pdf

1、白念珠菌是念珠菌病原體中最常見的一種條件性致病菌，由白念珠菌引起的感染逐年增多，受到國內外廣泛的重視。白念珠菌應答的一個主要環(huán)境因素為細胞外的pH，這種應答反應是由保守的真菌信號傳導途徑RIM101途徑所控制，許多依賴pH表達的基因受轉錄因子Rim101蛋白所調控。從宿主中獲得鐵的能力對于白念珠菌的定居和存活是必需的。白念珠菌鐵獲得系統(tǒng)的調控對其生存和毒力非常重要，而細胞外的不同pH條件影響著鐵離子的生物可利用率，因此推測鐵獲得系統(tǒng)受轉

2、錄因子Rim101蛋白調控。 為了研究Rim101蛋白與鐵代謝基因的相互作用，本實驗通過白念珠菌野生型、rim101-/-突變型及其回復突變型在不同pH和添加不同濃度的螯合劑BPS培養(yǎng)條件下的表型實驗，確定了Rim101蛋白是白念珠菌在堿性鐵限制環(huán)境中生長所必需的。構建了 LacZ報告基因與高鐵還原酶基因FRP1啟動子的融合質粒pNK1000，將其轉化野生型和rim101-/-突變型白念珠菌細胞，測定在不同培養(yǎng)條件下β-半乳糖苷

3、酶活性，結果表明：鐵代謝基因．FRP1表達的堿性pH上調是由鐵饑餓造成的，同時說明Rim101蛋白能夠正向調控FRP1的表達。高鐵還原酶基因FRP1的Northern雜交結果也證明了上述分析的結論。 為了驗證高鐵還原酶基因FRP1功能的重要性，利用基因敲除技術構建了白念珠菌高鐵還原酶基因FRP1的缺失突變株．frp1-/-，通過在不同濃度螯合劑BPS培養(yǎng)條件下的表型實驗發(fā)現，與野生型菌株相比，frp1-/-突變株對鐵饑餓環(huán)境更敏

4、感，說明Frp1蛋白是一種在堿性條件下起作用的高鐵還原酶。同時對FRP1啟動子區(qū)進行5’端缺失分析，構建了一系列的缺失片斷與LacZ的融合結構，初步分析表明FRP1基因啟動子的功能區(qū)幾乎覆蓋整個1kb的區(qū)域，-822～-437片斷缺失后 LacZ活性逐漸降低，說明該區(qū)域有促進啟動子活性的元件，-437～-263之間可能有強烈抑制啟動子活性的元件存在；而從-263～-124的缺失幾乎使得LacZ活性完全喪失。這為進一步研究FRP1基因的轉