拮抗菌產生的抑菌物質合成銀納米粒子的初步研究及五株新菌的鑒定.pdf

1、銀納米粒子(silver nanoparticles，AgNPs)具有許多獨特的物理化學特性，使其在光學、電子、催化以及醫(yī)藥領域等有著非常廣泛的應用。過去的數十年，許多制備技術已經能夠控制合成的銀納米粒子的粒徑、形狀和表面形貌。與傳統(tǒng)的物理化學方法相比，生物合成法利用細菌、真菌和植物等合成銀納米粒子，避免有毒化學試劑的使用，具有對環(huán)境無污染、成本低等優(yōu)點，吸引了眾多研究者的關注。本文以海洋沉積物樣品作為實驗對象，通過傳統(tǒng)的富集方法結合點

2、種法分離拮抗菌，并篩選出一株拮抗菌，利用其產生的抑菌物質合成銀納米粒子。利用紫外-可見分光光度法（UV-Visible spectrometry，UV-Vis）、掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscopy，SEM)和X射線衍射分析（X-ray diffraction，XRD）的方法對銀納米粒子進行表征;以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為抑菌對象，對銀納米粒子的抑菌性能進行檢測。
　　本實驗以威海小石島自然

3、海域(37°31′2″N122°1′19″E)采集的底泥樣品作為實驗對象，通過富集、稀釋涂布平板后，以大腸桿菌(Escherichia coli ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC29213)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii ATCC19606)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticusATCC17802T)四株病原菌作為指示菌株，以

4、點種法篩選出242株細菌，其中有177株細菌具有抑菌性?；?6S rDNA基因測序對拮抗菌進行鑒定，發(fā)現(xiàn)絕大多數菌株屬于厚壁菌門。
　　從分離到的拮抗菌中，挑選出一株拮抗性強的細菌DXFD1，經克隆測序得到其完整的16S rDNA序列(1474 bp)，經比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株DXFD1與枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilis subsp.subtilis NCIB3610T)的16S rDNA相似性最高(99.5

5、9％)。利用菌株DXFD1產生的抗菌物質溶液與AgNO3溶液混合，置于磁力攪拌器上合成銀納米粒子，并對合成的銀納米粒子進行UV-Vis光譜、SEM和XRD表征。結果顯示:銀納米粒子多為球形或近球形，粒徑分布在30-70 nm，含銀納米粒子的混合液的UV-Vis光譜顯示在480 nm處有吸收峰。以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為檢測菌株，對銀納米粒子的抑菌性能進行檢測。結果表明:銀納米粒子在實驗中表現(xiàn)出明顯的抑菌效果，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌

6、的最小抑菌濃度均為5μg/mL，最小殺菌濃度為10μg/mL。檢測去除表面附著物質的銀納米粒子的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)抑菌效果降低，結果表明抑菌物質在合成銀納米粒子的過程中結合到粒子表面，提高銀納米粒子的抑菌性能。
　　本文對從威海附近海域、文登鹽場、肥城精致鹽場樣品中分離到的編號為P131T、N62T、X7T、WDS2C4T與JZ3A21五株新菌進行了多相分類學鑒定。
　　菌株P131T分離自威海近海沉積物，為革蘭氏陰性菌、好氧、

7、無滑動性、細胞呈桿狀。菌株P131T的最適生長溫度為28-30℃，最適pH為7.0-7.5，可耐受的鹽度最為2.0-3.0％(w/v) NaCl?；?6S rDNA序列的分析表明，菌株P131T屬于比齊奧氏菌屬，與屬內物種的16S rDNA相似性范圍為94.6-97.0％。菌株P131T主要脂肪酸組分為iso-C15∶0、 iso-C15∶oG、iso-C17∶03-OH和iso-C171ω9c。主要的極性脂成分包括磷脂酰乙醇胺、兩種

8、氨脂質、氨磷脂、磷脂和其他的脂質。主要呼吸醌類型為MK-6?；蚪MDNA的G+C含量是36.7 mol％。根據遺傳學和表型特征證據，菌株P131T(=KCTC42587T=MCCC1H00124T)代表比齊奧氏菌屬的一個新物種，命名為沉積物比齊奧氏菌(Bizionia sediminis sp.nov.)。
　　菌株N62T分離自自威海近海沉積物，為革蘭氏陰性、兼性厭氧、無運動性和細胞短桿狀。2216E固體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)2天，形

9、成圓形、光滑、橘色和直徑約為0.6-1.5 mm的單菌落。菌株N62T最適生長溫度為28-30℃，最適pH為7.0-7.5和最適鹽度2.0-3.0％(w/v) NaCl。菌株N62T主要的脂肪酸組分是iso-C15∶0、iso-C15∶0G、iso-C17∶03-OH和C17∶13-OH。主要的呼吸醌類型是MK-6。菌株N62T基因組DNA的G+C含量是35.3 mol％。主要的極性脂是磷脂酰乙醇胺、兩種氨脂質、糖脂和三種其他的脂質?；?/p>

10、于16S rDNA序列的分析表明，菌株N62T屬于藏紅花黃色線菌科（Crocinitomicaceae），與寒冷微菌屬的物種的16S rDNA序列相似性范圍為95.8-97.2％。根據遺傳學和表型特征證據，菌株N62T(=KCTC42589T=MCCC1H00117T)，代表寒冷微菌屬的一個新物種，命名為橙色寒冷微菌（Brumimicrobium aurantiacum sp.nov.）。
　　菌株X7T分離自自威海近海沉積物，細

11、胞革蘭氏陰性、無滑動性、兼性厭氧和短桿狀。最適生長溫度為28-30℃，最適pH為7.0和最適鹽度2.0-3.0％（w/v）NaCl?；?6S rDNA序列的分析表明，菌株X7T屬于鹽坑微菌屬，與Salinimicrobium gaetbulicola有著最高的16S rDNA序列相似性(96.3％)。主要脂肪酸為anteiso-C15∶0、iso-C15∶0、 anteiso-C17∶1ω9c、iso-C17∶1ω9c、 C17∶02

12、-OH和iso-C17∶03-OH。主要極性脂是一種磷脂酰乙醇胺、一種磷脂、兩種氨脂質和五種其他未確定的脂質。主要呼吸醌類型是MK-6。基因組DNA的G+C含量是46.7mol％。遺傳學、表型特征以及化學組分結果表明，菌株X7T(=KCTC42585T=MCCC1H00115T)代表鹽坑微菌屬的一個新物種，命名為黃色鹽坑微菌(Salinimicrobium flavum sp.nov.)。
　　菌株WDS2C4T和JZ3A21分別

13、從文登鹽場、肥城精致鹽場的樣品分離到，細胞為革蘭氏陰性、長桿狀和無滑動性。生長范圍:可耐受鹽度1.0-20.0％(w/v)NaCl(最適6.0-10.0％)，溫度20-50℃（最適37-40℃）和pH6.5-9.5(最適7.0-8.0)。菌株WDS2C4T和菌株JZ3A21主要脂肪酸組分均是cyclo-C19∶0ω8c、summedfeatures8(C18∶1ω7cand/or C18∶1ω6c)、C18∶0、 C17∶0、C16∶0

14、和11-methyl C18∶1ω7c。菌株WDS2C4T和JZ3A21主要的呼吸醌類型是Q-10。菌株WDS2C4T的基因組DNA的G+C含量為67.7 mol％，菌株JZ3A21的基因組DNA的G+C含量為67.3mol％。菌株WDS2C4T主要極性脂成分是兩種磷脂、氨脂質、磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿和兩種糖脂。菌株WDS2C4T與Rhodovulum marinum JCM13300T的16SrDNA序列相似性最高為95.11％。與物

15、種Albidovulum xiamenense、Paracoccusaestuarii、Rhodobacter vinaykumarii和Roseiviv ax pacificus的模式菌株的相似性分別為94.75％、94.00％、93.88％和93.85％。根據16S rDNA序列建立的三個系統(tǒng)發(fā)育樹(Neighbour-joining，maximum-likelihood和maximum-parsimony)表明，菌株WDS2C4T