利用體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞克隆兔的研究.pdf

1、體細(xì)胞克隆技術(shù)，及其與基因打靶技術(shù)的結(jié)合為哺乳動(dòng)物的遺傳工程和基因組保存提供了新的機(jī)遇和方法。兔是一種常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，發(fā)展能夠從長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)胞系獲得克隆兔的技術(shù)，一直是兔克隆技術(shù)研究的熱點(diǎn)，也是一直未攻克的難題。本試驗(yàn)針對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了研究，在世界上獲得首例來(lái)自皮膚成纖維細(xì)胞的克隆兔，以及首例來(lái)自兔胚胎干細(xì)胞的克隆兔。 通過(guò)對(duì)不同激活條件和培養(yǎng)條件的研究，發(fā)現(xiàn)兩次電擊和化學(xué)激活能夠較好的激活兔M Ⅱ期卵母細(xì)胞，B2培養(yǎng)液是適

2、合兔孤雌胚胎發(fā)育的培養(yǎng)液。 通過(guò)對(duì)兔耳部皮膚組織的體外培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)研究，建立了兔成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和保存體系。在不同處理后的細(xì)胞周期的研究中發(fā)現(xiàn)血清饑餓培養(yǎng)不能顯著提高兔成纖維細(xì)胞GO/G1期細(xì)胞的比例。 在核移植試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)血清饑餓培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的克隆胚胎，比未經(jīng)血清饑餓培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的克隆胚胎在胚胎發(fā)育率上有顯著的提高。將來(lái)源于血清饑餓培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的467枚克隆胚胎移植給20只假孕母兔，結(jié)果

3、8只妊娠到期分娩，其中5只自然分娩出9只小兔，但它們?cè)诔錾笫靸?nèi)陸續(xù)死亡。另外3只假孕母兔經(jīng)剖腹產(chǎn)分娩5只小兔，其中3只存活至成年，2只有正常繁殖能力。微衛(wèi)星分析證明3只克隆兔的遺傳物質(zhì)和供體細(xì)胞兔一致。這說(shuō)明利用經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞能獲得有繁殖能力的克隆兔。 在利用兔胚胎干細(xì)胞進(jìn)行克隆兔的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，兔胚胎干細(xì)胞不適合直接用于核移植。分化后的胚胎干細(xì)胞用于核移植可以顯著的提高克隆胚胎的囊胚率。將421枚胚胎干細(xì)胞克隆