重組假絲酵母脂肪酶高密度發(fā)酵工藝放大及酶熱穩(wěn)定性研究.pdf

1、褶皺假絲酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase)基因工程菌的高密度發(fā)酵研究經(jīng)歷了從5L到800L規(guī)模的逐級(jí)放大過程，研究顯示在小規(guī)模(30L以下)發(fā)酵條件下，維持pH條件穩(wěn)定的指數(shù)流加控制方式即已能滿足高密度生產(chǎn)需求。隨著規(guī)模擴(kuò)大，諸多在小規(guī)模發(fā)酵時(shí)可忽略的因素，如環(huán)境穩(wěn)定、產(chǎn)物蛋白降解等，成為了新限制條件，對(duì)這些條件進(jìn)行的單因子和正交優(yōu)化研究表明，需要采用分段流加控制策略才能夠保證大規(guī)模發(fā)酵成功。該策略將發(fā)酵過程劃分為

2、兩個(gè)獨(dú)立階段，分別保持pH、溫度、攪拌等環(huán)境條件的穩(wěn)定，在48 hr時(shí)采用近穩(wěn)態(tài)方式進(jìn)行平穩(wěn)過渡。實(shí)驗(yàn)證明，該策略有利于維持菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物代謝平衡。800L，發(fā)酵實(shí)驗(yàn)獲得了穩(wěn)定的14000 IU ml-1脂肪酶酶活和約500 g l-1細(xì)胞濕菌重。該發(fā)酵工藝高效、廉價(jià)，具有大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的潛力。 耐熱脂肪酶研究結(jié)果顯示氨基酸殘基組成、寡肽片段組成和二元模式組成與蛋白耐熱性存在顯著關(guān)聯(lián)。Ala，His，Leu，Gly，Pro，Ph

3、e，Met，Trp，Tyr，KC，EE，KE，RE，VE，YI，EK，VK，EV，YV，EY, KY,VY, YY組成與耐熱性正相關(guān)；Asn，Arg，Cys，Ile，Gin，Glu，Lys，Thr，Ser，QC，QH，QN，HQ，MQ，NQ，QQ，TQ，QS，QT組成與耐熱性負(fù)相關(guān)。三種組成從不同層次，不同角度提取耐熱蛋白序列信息，相互關(guān)聯(lián)補(bǔ)充，較為全面的體現(xiàn)了序列性質(zhì)特征。采用SVM算法的嗜熱蛋白分類研究結(jié)果顯示，同時(shí)采用三肽片段特征

4、與二元模式特征的平均分類準(zhǔn)確率達(dá)到98％，采用三肽片段特征的平均分類準(zhǔn)確率達(dá)到96％，采用二元模式特征的平均分類準(zhǔn)確率達(dá)到95％，采用二肽片段特征的平均分類準(zhǔn)確率達(dá)到85％，而采用氨基酸殘基組成特征的平均分類準(zhǔn)確率達(dá)到74％。 在參考DNA重排(DNA Shuffling)實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了蛋白質(zhì)序列重排(Sequence Shuffling)技術(shù)，構(gòu)建了耐熱脂肪酶電子重組體庫(kù)。該文庫(kù)包含有15620條由5條嗜熱和常溫脂肪