基于宏基因組序列的黑熊腸道微生物組的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、中藥在我國(guó)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的地位舉足輕重，《中醫(yī)藥創(chuàng)新發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020年）》中明確提出，支持中藥材珍稀瀕危品種保護(hù)、繁育和替代品的研究。為開(kāi)發(fā)名貴中藥熊膽的人工替代品，科技部經(jīng)過(guò)反復(fù)考察論證，立項(xiàng)重大新藥創(chuàng)制“體外培育熊膽粉關(guān)鍵技術(shù)及臨床前研究”（2014ZX09301306）。熊膽成分復(fù)雜，其中具有藥學(xué)價(jià)值的主要成分為熊去氧膽酸，是通過(guò)腸道微生物中7α-羥基類(lèi)固醇脫氫酶（7α-HSDH）和7β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶（7β-HSDH

2、），以鵝去氧膽酸為底物轉(zhuǎn)化而來(lái)。黑熊作為能夠大量產(chǎn)生熊去氧膽酸的特殊物種，研究其腸道微生物的結(jié)構(gòu)與功能，并挖掘其中酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的7α-/7β-HSDH，具有重要的科學(xué)意義和工業(yè)價(jià)值。然而，自然界中大多數(shù)微生物是不可培養(yǎng)的，動(dòng)物腸道復(fù)雜的厭氧環(huán)境，更加限制了對(duì)其中微生物資源的開(kāi)發(fā)。
　　對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序使得我們能夠更快更好地了解其微生物組結(jié)構(gòu)與功能，挖掘其中的功能基因。因此，本文基于宏基因組學(xué)的研究策略，采集來(lái)自四川、云南

3、和黑龍江三個(gè)地區(qū)黑熊糞便樣品，比較不同地區(qū)黑熊腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)特征，揭示黑熊腸道微生物的共有微生物組成，解析黑熊腸道微生物組的基因功能分布，為認(rèn)識(shí)黑熊腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)及功能提供依據(jù)；在此基礎(chǔ)之上，挖掘并表征黑熊腸道微生物來(lái)源的7α-HSDH和7β-HSDH編碼基因，并對(duì)得到的7α-/7β-HSDHs進(jìn)行一系列酶學(xué)性質(zhì)研究，篩選出具有較高活性、較強(qiáng)催化效率和較好熱穩(wěn)定性的7α-/7β-HSDH，為熊去氧膽酸的生物轉(zhuǎn)化提供優(yōu)質(zhì)候選酶類(lèi)

4、，為體外培育熊膽粉的工業(yè)化提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　本文的主要內(nèi)容和結(jié)果：
　　①基于16S rRNA中V3-V4區(qū)域的序列信息，比較研究四川、云南和黑龍江三地的圈養(yǎng)黑熊腸道微生物菌群組成和結(jié)構(gòu)，共有12個(gè)門(mén)、192個(gè)屬的微生物被鑒定歸類(lèi)。其中，F(xiàn)irmicutes和Proteobateria是亞洲黑熊腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌群，這兩個(gè)門(mén)的微生物廣泛存在于3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的所有糞便樣品之中。Clostridium_sensu_stricto_1

5、， Turicibacter，(uncultured） Peptostreptococcaceae Incertae_Sedis， Peptostreptococcaceae Incertae_Sedis， Escherichia-Shigella， Clostridium_glycolicum和Streptococcus這7個(gè)屬為三地圈養(yǎng)黑熊的腸道菌群共有微生物；菌群 LefSe分析顯示，各組中差異分布最顯著的3個(gè)屬為Escheric

6、hia-Shigella，Streptococcus和Pseudomonas；Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析一致表明，四川和云南的圈養(yǎng)黑熊腸道微生物菌群類(lèi)似，在組成和結(jié)構(gòu)上無(wú)明顯差別，而黑龍江的圈養(yǎng)黑熊具有更加豐富的菌群多樣性，在組成和結(jié)構(gòu)上與先前兩地有明顯差異，提示生物地理學(xué)等因素可能對(duì)亞洲黑熊的腸道微生物組成產(chǎn)生影響。上述結(jié)果為認(rèn)識(shí)黑熊腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)及其特征提供依據(jù)。
　?、谕ㄟ^(guò)宏基因組學(xué)的研究方法，對(duì)來(lái)自四川、

7、云南和黑龍江的3個(gè)黑熊糞便樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，揭示黑熊腸道微生物組中的功能特征和代謝途徑。對(duì)序列進(jìn)行拼接、組裝和預(yù)測(cè)后，一共得到400118個(gè) ORFs，是一個(gè)巨大的微生物基因資源寶庫(kù)?；?COG數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋表明，黑熊腸道基因組中富含涉及Metabolism的功能基因，其中碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝基因和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝基因這兩類(lèi)含量最高；基于NR基因物種分類(lèi)表明，3個(gè)樣品中測(cè)序所得ORF基因大多來(lái)自Firmicutes；KEGG代謝網(wǎng)

8、絡(luò)顯示，黑熊糞便宏基因組中存在豐富的碳代謝、核酸代謝和氨基酸代謝通路。上述研究為理解黑熊腸道微生物菌群功能提供一定的理論參考，也為下一步挖掘其中的新穎生物催化劑提供了數(shù)據(jù)平臺(tái)。
　?、鄄捎帽镜?BLAST對(duì)比策略，從上述所得黑熊腸道宏基因組中挖掘、克隆putative7α-/7β-HSDH編碼基因，體外表達(dá)后表征催化功能，并對(duì)蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。共有38個(gè)putative7α-HSDH編碼基因和10個(gè)putative7β-

9、HSDH編碼基因被發(fā)現(xiàn)，克隆并表達(dá)了其中具有全長(zhǎng)序列的5個(gè)7α-HSDH編碼基因和1個(gè)7β-HSDH編碼基因；與課題組前期用于熊去氧膽酸生物轉(zhuǎn)化的、Clostridium absonum ATCC27555來(lái)源的7α-HSDH（Clo.sa-a）和7β-HSDH（Clo.sa-b）酶活比較顯示，黑熊腸道微生物組來(lái)源的7α-HSDH蛋白S1-a-1和S1-a-2顯示出優(yōu)越的催化活性，顯著高于Clo.sa-a，黑熊腸道微生物組來(lái)源的7β-H

10、SDH蛋白Y1-b-1也表現(xiàn)出良好的催化活性，與Clo.sa-b酶活相當(dāng)；6個(gè)重組蛋白所催化的酶促反應(yīng)產(chǎn)物HPLC檢測(cè)再次表明，使用宏基因組技術(shù)挖掘putative7α-HSDH和7β-HSDH的策略有效可行；蛋白同源性分析及氨基酸序列對(duì)比結(jié)果顯示出6個(gè)HSDH蛋白較高的同源性及保守的SDR超家族蛋白序列特征。
　?、軐?duì)黑熊腸道微生物組來(lái)源于的7α-/7β-HSDHs酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，并比較了它們與Clo.sa-a和C

11、lo.sa-b在酶學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)和熱穩(wěn)定性這兩方面的差異。蛋白S1-a-1催化效率顯著高于其它7α-HSDHs，是Clo.sa-a的10倍，Y1-b-1與Clo.sa-b催化效率相當(dāng)；在實(shí)驗(yàn)條件下，6個(gè)HSDH蛋白的最適pH均為堿性，集中在7.5-9.0之間，最適溫度集中在30-50C之間；酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，5個(gè)7α-HSDH的熱穩(wěn)定性與Clo.sa-a相當(dāng)，而Y1-b-1熱穩(wěn)定性?xún)?yōu)于Clo.sa-b，特別是在37C條件下，其熱穩(wěn)定性