NR2B轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)的分子機(jī)理研究.pdf

1、學(xué)習(xí)記憶是腦的一項(xiàng)高級神經(jīng)功能。N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體，特別是其NR2B亞基在學(xué)習(xí)記憶過程中起重要作用，揭示其生理功能對闡明學(xué)習(xí)記憶的具體分子機(jī)理具有重要意義。前腦特異過表達(dá)NR2B亞基的轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠表現(xiàn)為NMDA受體通道開放時(shí)間延長，活性增加，突觸對10-100Hz刺激的反應(yīng)增強(qiáng)，并在多種行為學(xué)測試中表現(xiàn)出更好的學(xué)習(xí)和記憶能力，但其確切的分子機(jī)理還未闡明。本研究首先利用

2、定量PCR技術(shù)檢測19月齡、24月齡Tg小鼠海馬和皮層中NMDA受體NR1、NR2A和NR2B三個(gè)亞基的表達(dá)情況，然后運(yùn)用基因芯片技術(shù)和定量PCR技術(shù)分別考察3月齡、19月齡和24月齡Tg小鼠海馬和皮層中基因的表達(dá)變化情況，再利用cluster3.0軟件進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因和相關(guān)的信號通路，初步探討Tg小鼠學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)的分子機(jī)理。 芯片結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)鈣釋放通道Ryranodine受體(RyR)及其相關(guān)基因Triadin2

3、(Trdn)和富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白(Hrc)，鈣/鈣調(diào)依賴的蛋白激酶Ⅳ(CaMIV)以及一些轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因的表達(dá)都發(fā)生了改變。RyR基因已被證實(shí)在學(xué)習(xí)記憶中具有重要作用，但是其作用機(jī)理以及NR2B如何對之調(diào)節(jié)還不清楚。在突觸后致密處，NR2B可通過PSD95-GFAP-Shank將Homer與NMDA受體復(fù)合物聯(lián)系起來。而在骨骼肌中，Homer-1c可通過與RyR1和RyR2互作來調(diào)節(jié)其功能。所以我們推測骨骼肌中RyR-Homer-1c

4、的互作也可能在腦中存在。另外，RyR不僅通過影響基因轉(zhuǎn)錄而影響學(xué)習(xí)記憶，而且還可被NO-cGMP-PKG通路激活，從細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放出大量的鈣，增加CREB的磷酸化水平并產(chǎn)生晚期長時(shí)程增強(qiáng)(L-LTP)。而NO也是NMDA受體的下游通路之一，并參與調(diào)節(jié)CREB的磷酸化過程。為了考察RyR基因在學(xué)習(xí)記憶中的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)分別利用熒光定量PCR技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)以及Westernblot等分子生物學(xué)技術(shù)，考察RyR1-3及其相關(guān)基因的表達(dá)

5、變化，RyR和Homer-1c的相互作用以及磷酸化的CREB蛋白水平的變化，進(jìn)一步探討Tg小鼠學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)的分子機(jī)理。 1.老年NR2B轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮層中NMDA受體三個(gè)亞基的表達(dá)情況運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測了19月齡、24月齡Tg小鼠海馬和皮層中NMDA受體NR1、NR2A和NR2B三個(gè)亞基的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明，在老年Tg小鼠中NMDA受體三個(gè)亞基的表達(dá)量均明顯高于對照組的。 2.NR2B轉(zhuǎn)基因小

6、鼠基因表達(dá)譜分析運(yùn)用基因芯片技術(shù)考察了3月齡、19月齡和24月齡Tg小鼠海馬和皮層基因的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明，以基因表達(dá)變化倍數(shù)大于1.5或小于0.66作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在3月齡Tg小鼠海馬和皮層中分別篩選到248和179個(gè)差異表達(dá)基因，而19月齡Tg小鼠中分別為225和457個(gè)，當(dāng)Tg小鼠24月齡時(shí)差異表達(dá)基因明顯增多，分別高達(dá)733和719個(gè)。利用定量PCR技術(shù)對一些重要的差異表達(dá)基因及相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并通過cluster

7、3.0軟件對三種不同年齡小鼠兩個(gè)腦區(qū)的芯片結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NR2B過表達(dá)導(dǎo)致很多離子通道基因如鉀離子通道、鈣離子通道、鈉離子通道和陰離子通道等基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化。另外，GABA-A受體、離子型和代謝型谷氨酸受體、5-羥色胺受體、煙堿型類膽堿受體等多個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)受體以及參與突觸小泡轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸?shù)幕蛟诓煌挲g的Tg小鼠的海馬和皮層兩個(gè)腦區(qū)也都發(fā)生了比較相似或一致的變化。很多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因在不同年齡的Tg小鼠的海馬和皮層兩

8、個(gè)部位都發(fā)生了相似的改變，這類基因主要包括蛋白激酶、蛋白磷脂酶和編碼調(diào)控GTP酶活力或Ras相關(guān)通路的一些基因。我們的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)/細(xì)胞骨架相關(guān)基因也被NR2B過表達(dá)所改變。這些基因主要包括大量的肌漿球蛋白相關(guān)基因、角蛋白復(fù)合物基因以及參與微管運(yùn)動(dòng)的基因。NR2B過表達(dá)還引起了轉(zhuǎn)錄因子和參與各種轉(zhuǎn)錄過程的基因表達(dá)改變，轉(zhuǎn)錄因子如fos、即早基因2、4和Crem、Creb313和Creb314以及CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白等。在Tg小鼠中，

9、胰島素樣生長因子家族基因、泌乳刺激素，neurturin以及纖維原細(xì)胞生長因子相關(guān)基因的表達(dá)都發(fā)生了顯著變化。另外，核受體亞家族成員、interleukin受體、G蛋白偶聯(lián)受體、神經(jīng)肽Y受體等基因的表達(dá)也被影響。在三種不同年齡的Tg小鼠中，大量發(fā)育相關(guān)的基因呈現(xiàn)相似的表達(dá)變化趨勢，特別是一些參與軸突生成和神經(jīng)發(fā)生的基因以及一些Notch通路基因。有趣的是，在Tg小鼠中，大量凋亡相關(guān)基因的表達(dá)也發(fā)生了改變。另外，在Tg小鼠中，NR2B過表

10、達(dá)很可能影響了重要蛋白的水解過程，因?yàn)榇罅康聂入拿?、組織蛋白酶以及絲氨酸(或蘇氨酸)蛋白酶抑制子等基因在不同年齡的Tg小鼠海馬和皮層中的表達(dá)都發(fā)生了改變。此外，很多參與各種轉(zhuǎn)運(yùn)過程的基因的表達(dá)也被NR2B過表達(dá)所影響，如參與電子傳遞、葡萄糖運(yùn)輸、脂肪運(yùn)輸、氨基酸運(yùn)輸?shù)幕虻取?3.NR2B轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶增強(qiáng)的可能分子機(jī)理利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了3月齡、19月齡和24月齡Tg小鼠海馬和皮層中RyR相關(guān)基因包括RyR1-3、

11、Trdn、Homer-1c和Hrc，CaMKIV和一些轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因如Fos、Egr2，Egr4和Crem的表達(dá)。結(jié)果表明，在不同年齡的Tg小鼠的海馬和皮層中，各基因分別發(fā)生了不同程度的改變。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RyR蛋白和Homer-1c蛋白在小鼠海馬和皮層中能以復(fù)合物的形成存在，二者可直接互作。Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磷酸化的CREB蛋白在3月齡Tg小鼠的海馬和皮層中的表達(dá)高于對照組中的，尤其是海馬中的更為顯著。