擬南芥AtNHX8基因的克隆及其功能研究.pdf

1、擬南芥單價(jià)陽(yáng)離子：質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器-1(CPAl)家族共包括8個(gè)成員，命名為AtNHX1-AtNHX8。AtNHXl和AtNHX7/SOS1已經(jīng)分別被證明為位于液泡膜及細(xì)胞質(zhì)膜的Na<'+>/H<'+>反向轉(zhuǎn)運(yùn)器。AtNHX2-6在進(jìn)化關(guān)系上與AtNHX1比較接近，而AtNHX8與AtNHX7/SOS1同源性較高。本論文的研究工作主要是對(duì)AtNHX8(Atlg14660)進(jìn)行功能鑒定。 以擬南芥為材料，克隆了AtNHX8的CDS和

2、基因組DNA，并利用C-端親水區(qū)進(jìn)行了原核表達(dá)(GST標(biāo)簽)，純化融合蛋白并制備了多克隆抗體。 從SALK突變體中心訂購(gòu)了AtNHX8 T-DNA 插入缺失突變體，經(jīng)過(guò)篩選和鑒定后命名為nhx8-1(salk-070497)和nhx8-2(salk-086336)。AtNHX8 T-DNA插入缺失突變體nhx8-1和nhx8-2對(duì)Li<'+>脅迫比野生型敏感，但是對(duì)其它一價(jià)陽(yáng)離子如Na<'+>、K<'+>、Cs<'+>的處理都沒(méi)

3、有表現(xiàn)出與野生型有明顯的差異。 利用酵母功能缺失突變體進(jìn)行了功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。在一個(gè)缺失Na<'+>/H<'+>反向轉(zhuǎn)運(yùn)器的三缺失酵母突變體AXT3中異源表達(dá)該基因，可以專(zhuān)一性的恢復(fù)該酵母突變體對(duì)Li<'+>敏感的表型，而不能影響其對(duì)Na<'+>或其它毒害離子的敏感性。我們分別以sosl-1突變體和野生型擬南芥為背景，對(duì)AtNHX8進(jìn)行了超表達(dá)。在sos1-1突變體及野生型擬南芥中超表達(dá)AtNHX8，提高了sos1-1及野生型擬南芥

4、對(duì)Li<'+>脅迫的耐受性，而對(duì)Na<'+>及其它離子的脅迫處理沒(méi)有表現(xiàn)出與野生型明顯的差異。超表達(dá)AtNHX8的轉(zhuǎn)基岡植株可以耐受50 mM LiCl脅迫，而野生型擬南芥在20mM LiCl處理下便不能繼續(xù)生長(zhǎng)。 在LiCl脅迫下，nhx8的Li<'+>含量較野生型要高一些，這和超表達(dá)植株的結(jié)果正好相反，超表達(dá)植株的Li<'+>含量較野生型要低。這個(gè)測(cè)定結(jié)果表明AtNHX8可能是在行使一個(gè)反向轉(zhuǎn)運(yùn)器的功能。離子含量測(cè)定結(jié)果同時(shí)

5、顯示，隨著LiCl濃度的增加，擬南芥的Li<'+>含量是升高的，而K<'+>含量是隨之降低的。然而，與野生型相比，超表達(dá)植株體內(nèi)的K<'+>含量較高而突變體nhx8較低，這個(gè)結(jié)果預(yù)示著K<'+>營(yíng)養(yǎng)對(duì)于植物在LiCl脅迫下的生長(zhǎng)是非常必要的。AtNHX8可能在保持K<'+>吸收以及維持體內(nèi)離子平衡方面發(fā)揮重要的作用。 RT-PCR結(jié)果顯示，AtNHX8在轉(zhuǎn)錄水平不受處理的鹽離子誘導(dǎo)。對(duì)器官表達(dá)特異性分析，發(fā)現(xiàn)AtNHX8在成熟擬

6、南芥植株的根、莖、葉和花等器官中均有表達(dá)。對(duì)AtNHX8啟動(dòng)子-GUS的轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)其在葉片、根及根毛等部位均有表達(dá)。對(duì)AtNHX8-EGFP融合蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)AtNHX8可能定位于細(xì)胞質(zhì)膜。 綜上所述，我們的初步研究結(jié)果表明，AtNHX8可能編碼一個(gè)質(zhì)膜的Li<'+>/H<'+>反向轉(zhuǎn)運(yùn)器，它在減輕Li<'+>對(duì)植物的危害以及維持胞內(nèi)離子平衡等方面發(fā)揮重要的作用。就我們所知，這是目前植物中第一個(gè)