啟動子低甲基化導(dǎo)致NGALR在食管癌中過表達(dá).pdf

1、NGAL基因是一重要的腫瘤相關(guān)基因,它在結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、食管癌等多種腫瘤表達(dá)上調(diào)。近來,一種特異的24p3/NGAL細(xì)胞表面受體24p3R/NGALR從鼠類的FL5.12細(xì)胞被分離出來。研究表明,NGALR mRNA在慢性髓性白血病中表達(dá)下調(diào)而在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)。然而 NGALR的調(diào)控機(jī)制還未知。在本研究中我們展示了NGALR的表達(dá)模式并檢測了該基因在食管癌及細(xì)胞系中的異常甲基化。首先,我們采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測

2、了59例食管癌及其相對應(yīng)的正常食管鱗狀上皮石蠟包埋組織樣品中NGALR基因的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果的定量揭示了NGALR在食管癌中的表達(dá)高于正常食管上皮具有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。其次,采用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),我們檢測了20例配對食管癌組織和正常組織及細(xì)胞系中 NGALR mRNA水平。NGALR1和NGALR2的mRNA分別在14例15例食管癌中表達(dá)上調(diào),NGALR1 mRNA和NGALR2 mRNA在13例中共同表達(dá)上調(diào)

3、。 NGALR mRNA在三種食管癌細(xì)胞系中表達(dá),然而在兩種食管癌細(xì)胞系和永生化食管上皮細(xì)胞系中未檢測到表達(dá)。再次,我們將NGALR基因5’側(cè)翼轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)不同長度片段分別克隆到pGL3-Basic質(zhì)粒中,構(gòu)建NGALR基因5’側(cè)翼轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)系列熒光素酶報告基因表達(dá)載體,并通過轉(zhuǎn)染進(jìn)一步分析了它們在NGALR表達(dá)細(xì)胞EC8712和不表達(dá)細(xì)胞EC109中的活性。EC8712細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染分析表明,所有的NGALR啟動子均顯示了良好的活性。與

4、EC109細(xì)胞相對比, NGALR啟動子在EC8712細(xì)胞中具有良好的報告基因活性。最后,我們采用甲基化特異性PCR及亞硫酸氫鹽修飾基因組測序法檢測了食管癌組織及細(xì)胞系中NGALR的甲基化狀態(tài)。在缺乏NGALR表達(dá)的細(xì)胞系可以檢測到NGALR甲基化,而在NGALR表達(dá)的細(xì)胞系則未檢測到NGALR甲基化。盡管存在不同的效率,使用甲基化抑制劑5-aza-2’-deoxycytidine處理NGALR甲基化的細(xì)胞系(EC109、SHEEC和S