鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因的克隆、功能及產(chǎn)生機(jī)制研究.pdf

1、鹽生杜氏藻(Dunaliella salina，簡(jiǎn)稱鹽藻)是一種迄今為止發(fā)現(xiàn)的世界上最耐鹽的真核光合生物，可以在0.3％到飽和鹽濃度的范圍內(nèi)生長(zhǎng)。鹽藻是單細(xì)胞綠藻，沒(méi)有細(xì)胞壁，生長(zhǎng)快，是一種很好的研究鹽脅迫和滲透脅迫的模式物種。鹽藻是通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)快速而大量的合成甘油來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡的。本實(shí)驗(yàn)室首次從鹽藻中克隆到了甘油合成途徑上的關(guān)鍵酶基因一3-磷酸甘油脫氫酶的兩個(gè)同工酶基因GPDHl和GPDH2。為了搞清楚GPDHZ和GPDH2

2、在鹽藻細(xì)胞里的具體分工，揭示兩種同工酶特殊的基因結(jié)構(gòu)與其高效甘油轉(zhuǎn)化效率之間的關(guān)系，以及這兩個(gè)新基因產(chǎn)生的分子機(jī)制與鹽藻進(jìn)化之間的關(guān)系。本論文研究了GPDHl和GPDH2兩種同工酶基因在脅迫條件下的表達(dá)與甘油合成動(dòng)態(tài)變化之間的關(guān)系，并對(duì)3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因進(jìn)行生物信息分析、大腸桿菌表達(dá)、以及重組蛋白的酶活特性研究和基因組結(jié)構(gòu)比較分析。取得的結(jié)果如下： 1、克隆獲得了鹽藻3-磷酸甘油脫氫酶基因GPDHl，通過(guò)對(duì)鹽藻的GPD

3、Hl和 GPDH2進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)這兩條同工酶都具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即絲氨酸磷 酸化酶(SerB)結(jié)構(gòu)域和3-磷酸甘油脫氫酶(GPD)結(jié)構(gòu)域，相對(duì)于其它 已經(jīng)報(bào)道的植物3-磷酸甘油脫氫酶多出來(lái)一個(gè)SerB結(jié)構(gòu)域。因此，我們認(rèn) 為鹽藻的GPDHl和GPDH2是兩條新基因，它們的SerB結(jié)構(gòu)域具有3-磷酸甘油磷酸化酶的功能，這樣GPDHl和GPDH2就能直接催化磷酸二羥丙 酮(DHAP)產(chǎn)生甘油，大大加速了甘油的合成效率。這也可以解

4、釋鹽藻能 夠快速而大量的合成甘油這一特點(diǎn)。 2、通過(guò)大腸桿菌表達(dá)和純化，我們驗(yàn)證了具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的GPDH2重組蛋白可 以直接催化DHAP產(chǎn)生甘油，從而證明了新基因GPDH2的新功能就是直接催 化DHAP產(chǎn)生甘油。由于GPDHI和GPDH2結(jié)構(gòu)上高度相似，所以我們猜測(cè)GPDHI 也可以直接催化DHAP產(chǎn)生甘油。 3、采用real-timc PCR和Northern雜交研究了這兩個(gè)同工酶基因的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)GPDH

5、I受到鹽脅迫的誘導(dǎo)，而且也受到氧化脅迫和厭氧脅迫的誘導(dǎo)；而GPDH2受到鹽脅迫和厭氧脅迫的誘導(dǎo)，卻受到氧化脅迫的抑制。同時(shí)我們檢測(cè)了各種脅迫下鹽藻細(xì)胞甘油合成的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)氧化脅迫和鹽脅迫下，鹽藻細(xì)胞的甘油合成增加的速率幾乎一樣，說(shuō)明在氧化脅迫下GPDH2表達(dá)的降低幾乎不影響甘油的合成效率。和釀酒酵母的GPD1和GPD2相比較，我們認(rèn)為，鹽藻的GPDH1和酵母的GPD1相似，主要負(fù)責(zé)在有氧情 況下合成甘油；而鹽藻的GPDH2和酵母的

6、GPD2相似，主要負(fù)責(zé)在無(wú)氧情況下合成甘油。 4、我們認(rèn)為鹽藻的新基因GPDH1和GPDH2能直接催化DHAP產(chǎn)生甘油是鹽藻能快速而大量合成甘油的關(guān)鍵所在，和耐鹽密切相關(guān)，是鹽藻生活在高鹽環(huán)境下進(jìn)化的產(chǎn)物，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)初步探討了新基因GPDH2產(chǎn)生的分子機(jī)制。用GPDH2的SerB結(jié)構(gòu)域作為探針進(jìn)行SotJthern雜交，D.salina和 D.bardawil都出現(xiàn)了兩條很明顯的條帶；用GPDH2的GPD結(jié)構(gòu)域作為探針 進(jìn)

7、行Southern雜交，D.salina和D.bardawi都只出現(xiàn)了一條清晰的條帶。 在分析GPDH2的基因組結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)SerB結(jié)構(gòu)域相對(duì)應(yīng)的基因組區(qū)域存在 內(nèi)含子。所以我們認(rèn)為新基因GPDH2產(chǎn)生的分子機(jī)制是“基因復(fù)制”，即位 于染色體上另一位點(diǎn)的親本SerB基因通過(guò)復(fù)制產(chǎn)生一個(gè)新的拷貝，這個(gè)拷 貝再插入到3-磷酸甘油脫氫酶基因的5’端，從而產(chǎn)生了現(xiàn)在這個(gè)結(jié)構(gòu)奇特 的GPDH2新基因；當(dāng)我們用杜氏藻的淡水藻種D.late