喜樹堿對HaCaT細胞、人原代角質形成細胞自噬及凋亡的影響.pdf

1、目的:觀察喜樹堿對HaCaT細胞、人原代角質形成細胞（KCs）自噬和凋亡的影響，從而探討喜樹堿治療銀屑病的機制。
　　方法:①將HaCaT細胞分為對照組和實驗組，對照組為0.1%二甲基亞砜（DMSO），實驗組分別為5、10、25、50、100、200 nmol/L濃度的喜樹堿。藥物處理細胞24、48 h，用CCK8法檢測細胞的增殖情況，流式細胞儀檢測藥物作用24 h的細胞凋亡情況，Western blot檢測自噬相關蛋白微管相關蛋

2、白1輕鏈3（LC3）、p62的變化，選取10 nmol/L喜樹堿作用于HaCaT細胞24 h，間接免疫熒光法觀察細胞自噬蛋白LC3的變化，透射電鏡觀察自噬體超微結構，確認喜樹堿對HaCaT細胞自噬的誘導效應。
　　②取行包皮環(huán)切術青少年的包皮組織，分離提取人原代角質形成細胞，取第三代細胞用于各項實驗，實驗組喜樹堿濃度為200nmol/L、2μmol/L、6μmol/L，對照組為0.1% DMSO，藥物處理細胞24h、48h后，采用

3、CCK8法檢測細胞增殖情況，流式細胞儀檢測藥物作用24 h的細胞凋亡情況，Western blot檢測自噬相關蛋白LC3、p62的變化，選取2μmol/L濃度喜樹堿作用于細胞24 h，間接免疫熒光法檢測細胞自噬蛋白LC3的變化，透射電鏡觀察自噬體超微結構，進一步確認喜樹堿對其自噬的誘導效應，免疫組化觀察銀屑病皮損部位和正常表皮LC3表達水平。
　　③統(tǒng)計學分析：統(tǒng)計分析采用SPSS17.0軟件，計量資料以?x±s表示。各均數經Le

4、vene檢驗方差齊性。細胞的增殖抑制率以及凋亡率統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，各組間的多重比較采用Dunnett t檢驗，間接免疫熒光檢測自噬體陽性細胞率采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:①5、10、25 nmol/L喜樹堿對HaCaT細胞的增殖、凋亡無顯著影響，50、100、200nmol/L喜樹堿作用 HaCaT細胞24 h的增殖抑制率分別為(31.23±1.00)%，(54.21±8.10)%，(

5、66.75±10.70)%；25、50、100、200nmol/L喜樹堿作用 HaCaT細胞48h的增殖抑制率分別為(25.81±5.99)%、(44.35±5.32)%、(65.81±8.28)%、(73.23±9.59)%，與相同時段的對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（p均<0.001）。50、100、200nmol/L喜樹堿作用 HaCaT細胞24 h的凋亡率分別為(14.46±2.38)%、(19.15±1.59)%、(29.88±

6、1.37)%，與對照組(3.80±0.13)%比較，差異有統(tǒng)計學意義（P均<0.001）。5、10 nmol/L喜樹堿處理HaCaT細胞24 h后，LC3Ⅱ表達上調，p62蛋白表達下調。間接免疫熒光觀察到10nmol/L喜樹堿作用細胞24h后的綠色熒光聚集點明顯增多，實驗組與對照組的自噬體陽性細胞百分率分別為（36.67±4.55）%、6.23±0.92）%，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=6.546，p=0.0028）。透射電鏡觀察到10n

7、mol/L喜樹堿作用細胞24h自噬體和自噬溶酶體的形成。
　　②2μmol/L、6μmol/L喜樹堿作用原代角質形成細胞24 h的增殖抑制率分別為（33.90±3.65）%、（51.72±5.06）%，與對照組（1.60±0.78）%相比差異有統(tǒng)計學意義,200nmol/L喜樹堿作用原代角質形成細胞24 h的增殖抑制率為（7.59±1.82）%，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。200nmol/L、2μmol/L、6μmol/L喜樹堿

8、作用原代角質形成細胞48 h的增殖抑制率分別為（19.21±5.74）%、（52.09±3.01）%、（63.37±5.45）%，與對照組（4.18±1.56）%相比，差異有統(tǒng)計學意義。200nmol/L、2μmol/L、6μmol/L喜樹堿作用原代角質形成細胞24 h的凋亡率分別為（15.90±2.14）%、（29.33±3.51）%、（35.28±3.05）%，與對照組（2.30±1.68）%比較，差異有統(tǒng)計意義。2μmol/L、6

9、μmol/L喜樹堿處理原代角質形成細胞24 h后，LC3Ⅱ顯著上調，p62蛋白表達下調。間接免疫熒光觀察到2μmol/L喜樹堿作用原代角質形成細胞24h后的綠色熒光聚集點，實驗組與對照組的自噬體陽性細胞百分率分別為（60.16±8.78）%、（38.96±13.12）%，統(tǒng)計方法采用獨立樣本t檢驗，差異具有統(tǒng)計學意義（t=3.003，p=0.017）。透射電鏡觀察到2μmol/L喜樹堿作用原代角質形成細胞24h自噬體和自噬溶酶體的形成；