F10基因功能初步研究.pdf

1、目的：在研究葡萄胎發(fā)病機制的過程中，發(fā)現(xiàn)了一系列葡萄胎組織高表達的基因，其中F10是一個未知功能的新基因。在前期工作中判斷F10與滋養(yǎng)細胞腫瘤及腺癌相關，但在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義未知，為此，我們對其進行了初步探索：1.觀察F10在組織中的分布；2.F10在細胞內(nèi)的定位；3.了解F10表達產(chǎn)物對細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導通路的影響。期望通過以上分析，了解該基因的生物學功能，以及在腫瘤形成中可能的作用。 方法：1.F10基因克隆和序列分析

2、提取葡萄胎組織RNA，以之為模板通過RT-PCR擴增出F10的完整編碼序列，將其連接至pMD18-T載體，酶切鑒定后測序，并對序列進行生物信息學分析。在此基礎上，構建F10的真核表達載體pRC/CMV2-F10(包括正向和反向真核表達載體)和原核表達載體pET-GST/F10。 2.F10的組織分布利用原位雜交和免疫組化方法在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平研究基因表達的組織特異性。以pRC/CMV2-F10(-)質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄制備地高辛標

3、記的mRNA探針用于原位雜交實驗。pET-GST/F10質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在IPTG誘導下表達F10蛋白，親和層析純化蛋白，純化的蛋白免疫動物制備多克隆抗體，用于免疫組化的方法分析F10蛋白在多種器官和組織的表達水平。 3.F10基因的細胞內(nèi)定位和對重要信號通路的影響構建F10與pEGFP的真核融合表達載體pEGFP/F10，將pEGFP/F10瞬時轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞MCF-7后觀察F10在活細胞中的定位。將pRC/CMV2-F

4、10(+)、pRC/CMV2-F10(-)、pRC/CMV2與報道系統(tǒng)-3-AP1-luc、NFkb-luc瞬時共轉(zhuǎn)染16HBE細胞，測定螢火蟲熒光素酶活性，利用螢火蟲熒光素酶報道系統(tǒng)分析F10對細胞重要信號通路的作用。 結果：1.成功擴增F10完整編碼序列，總長度為980bp，與pMD18-T載體連接后酶切，結果符合預期設計，并且有正、反連接的pMD18-T/F10載體。經(jīng)測序后的F10序列網(wǎng)上提交，登陸號是AB196290

5、。將F10序列與GeneBank上提供的核酸序列相比較，所獲得的高度同源基因均為假想基因，或者基因組序列的一部分，功能不明。此外，成功構建了F10的真核和原核表達重組質(zhì)粒。 2.以pRC/CMV2-F10(-)質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄獲得F10基因的mRNA探針，探針標記效率可以達到原位雜交要求。原核表達的GST-F10融合蛋白分子量正確，并以HIS-tag抗體進行westernblot驗證表達序列正確；以純化的F10/GST融合蛋

6、白免疫新西蘭大白兔，獲得的抗血清ELISA檢測抗體效價達1：20000，westernblot分析靈敏度至少達20ng。原位雜交和免疫組化發(fā)現(xiàn)F10基因在食道、結腸、胰腺、神經(jīng)節(jié)衛(wèi)星細胞、子宮頸、子宮等正常組織和結腸腺癌、食道、子宮鱗癌等癌組織中均呈陽性表達，免疫組化還發(fā)現(xiàn)F10蛋白在子宮頸和食道粘膜的復層扁平上皮細胞以及腸道的單層柱狀上皮細胞中的分布存在極性。 3.酶切和測序結果證實成功構建了pEGFP/F10的融合表達載體

7、，將pEGFP/F10瞬時轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，在熒光顯微鏡下觀察可見F10主要分布在細胞質(zhì)中，呈現(xiàn)非均勻分布，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細胞器的特異性熒光染料有重疊，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重疊的范圍最為明顯。也有小量細胞中F10作用在細胞核，或者核漿均有分布。利用螢火蟲熒光素酶報道系統(tǒng)AP1-luc、NFkb-luc分析F10在細胞增殖分化中的作用，可見在轉(zhuǎn)染F1024h后的細胞中，luc活性較轉(zhuǎn)染了反義F10及空載體的細胞顯著下降，但后兩者無顯著

8、性差異；而在轉(zhuǎn)染后36h和48h，三者luc活性均下降，無顯著性差異。 結論：1.F10蛋白是在多種組織普遍表達的細胞內(nèi)蛋白，并在腫瘤組織中有增強表達的-4-趨勢。其中在復層扁平上皮、神經(jīng)節(jié)衛(wèi)星細胞、胰腺以及消化道黏膜表達最為強烈；在正常的消化道和子宮頸粘膜中F10蛋白分布出現(xiàn)極性，說明F10不是一種腫瘤特異性基因，更可能與細胞分泌、代謝或者極性相關。 2.F10主要分布在細胞質(zhì)中，可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細