PTEN調(diào)控肝纖維化小鼠肝臟巨噬細胞極化及相關(guān)機制的研究.pdf

1、背景：肝纖維化（hepatic fibrosis）是各種病因所致慢性肝損傷的持續(xù)性病理修復(fù)過程，表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)（ECM）沉積。持續(xù)的肝纖維最終可能會導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌。肝臟中固有的巨噬細胞稱為枯否細胞（Kupffer cell，KCs），KCs分泌細胞因子促進HSC的活化是肝纖維化發(fā)病機制的關(guān)鍵事件。研究表明，在肝纖維化進程中，KCs能夠極化分型為經(jīng)典激活巨噬細胞（M1型）和替代激活巨噬細胞（M2型）發(fā)揮調(diào)控作用。其中M2型巨噬細胞能

2、分泌促纖維化因子IL-10、TGF-β等進而促進纖維化形成。探討肝纖維化過程中KCs極化的調(diào)控規(guī)律，是防治肝纖維化的重要方法之一。
　　第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(phosphates and tensing homologue deleted on chromosome10，PTEN)是一種腫瘤抑制因子，其編碼的蛋白具有雙重特異性磷酸酶活性，能通過負調(diào)控PI3K/Akt信號通路參與調(diào)控機體固有免疫。PTEN在

3、肝纖維化病程中發(fā)揮重要作用，但其作用機制還不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在腫瘤相關(guān)巨噬細胞和脂肪組織相關(guān)巨噬細胞極化中發(fā)揮重要作用。PTEN是否通過調(diào)控KCs極化參與肝纖維化病程，還未見文獻報道。本課題擬以肝纖維化形成與逆轉(zhuǎn)小鼠模型為研究對象，研究PTEN對肝臟巨噬細胞極化的調(diào)控作用及其可能的作用機制。
　　方法：在體實驗，10%四氯化碳(CCl4)皮下注射C57BL/6小鼠，連續(xù)8周，每周兩次，為肝纖維化進展組；停止注射，自然恢復(fù)

4、8周為肝纖維化逆轉(zhuǎn)組。取各時期肝臟組織和原代肝臟巨噬細胞(KCs)，檢測肝臟病理變化及肝纖維化相關(guān)指標(biāo)，確立肝纖維化進展及逆轉(zhuǎn)模型建立成功。采用免疫組化、RT-qPCR和Western Blot方法檢測肝纖維化進展及逆轉(zhuǎn)小鼠肝臟巨噬細胞是否發(fā)生極化分型，接著檢測小鼠肝臟巨噬細胞中PTEN表達的變化。
　　離體實驗，LPS和IL-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7極化分型，通過RT-qPCR、Western Blot和免疫熒光染色檢

5、測不同極化分型中PTEN表達的變化。然后轉(zhuǎn)染siPTEN和pEGFP-N1-PTEN進細胞，RT-qPCR、Western Blot、ELISA、免疫熒光染色和流式細胞術(shù)方法檢測巨噬細胞極化標(biāo)志物的變化。同時檢測Akt、p-Akt、STAT6和p-STAT6的表達變化確定PTEN與PI3K/Akt/STAT6信號通路的關(guān)系。LY294002是PI3K/Akt的特異性阻斷劑，RT-qPCR、Western Blot和ELISA方法檢測LY

6、294002處理對巨噬細胞極化標(biāo)志物表達的影響。
　　結(jié)果：在體實驗發(fā)現(xiàn)肝纖維化進展及逆轉(zhuǎn)期小鼠KCs極化分型為混合的M1和M2型。且肝纖維化進展組KCs中PTEN表達逐漸降低，而逆轉(zhuǎn)期則逐漸升高并接近正常水平。體外RAW264.7細胞中發(fā)現(xiàn)M2型細胞中PTEN表達降低。轉(zhuǎn)染siPTEN結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN表達降低能明顯增加M2型標(biāo)志物表達，而過表達PTEN則顯著減少M2型標(biāo)志物表達。PTEN表達減少，磷酸化的Akt和磷酸化的STAT