整合素β6在膽管癌中的表達狀況及作用機制研究.pdf

1、研究背景和意義：
　　膽管癌(Cholangiocarcinoma)最早在1840年由Durand-Fardel教授報道，該腫瘤是一種膽管上皮源性的、高度惡性的腫瘤。在2010年第七版美國癌癥聯(lián)合委員會(the American Joint Committee on Cancer，AJCC)的分類中，根據(jù)發(fā)生部位不同膽管癌可以分為肝內(nèi)膽管癌(ICC)和肝外膽管癌(ECC)。ICC源于肝內(nèi)膽管以及其細小分支膽管樹的襯覆上皮;而對于E

2、CC，以膽囊管與肝總管匯合處分界，可進一步分為肝門部膽管癌（又稱Klatskin瘤）和遠端膽管癌。盡管在世界范圍內(nèi)，膽管癌的發(fā)病率僅占所有消化系統(tǒng)惡性腫瘤的3％左右，但作為肝膽系統(tǒng)第二常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率，尤其是ICC，近年來持續(xù)增高。目前為止，根治性手術(shù)切除是膽管癌唯一有效的根治方法。然而，由于該病起病隱匿、無特征性的早期臨床表現(xiàn)，且該腫瘤極易發(fā)生淋巴結(jié)和遠端轉(zhuǎn)移，患者往往在確診時就已經(jīng)處于腫瘤晚期，失去了根治性切除

3、的機會。此外，膽管癌對輔助放療及化療的敏感性低，放化療并不能有效降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險。上述這些因素導(dǎo)致絕大多數(shù)膽管癌患者的預(yù)后不良，5年生存率只有5％左右。因此，探尋在膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中，尤其是其侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用的分子，明確其侵襲及轉(zhuǎn)移的機制，對于治療膽管癌和降低死亡率具有十分重要的意義。
　　整合素屬于細胞表面黏附分子家族成員，是一類由α亞單位及β亞單位以非共價鍵結(jié)合的方式組成的跨膜糖蛋白受體。整合素αvβ6是迄今為

4、止發(fā)現(xiàn)的唯一一種含有β6亞基的整合素，其表達特征為在胚胎發(fā)育時期、組織修復(fù)時以及在惡性上皮性腫瘤組織中高表達，而在正常上皮組織、上皮良性腫瘤組織以及其它類型惡性腫瘤組織中不表達?，F(xiàn)階段研究已經(jīng)證實整合素αvβ6在胃癌、結(jié)直腸癌(CRC)、胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)等多種消化道惡性腫瘤中表達顯著提高，且αvβ6的表達水平與上述多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。此外，整合素αvβ6可通過活化多種經(jīng)典的促癌信號通路而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來我們

5、團隊研究發(fā)現(xiàn)αvβ6并不是固定表達于細胞膜表面，而是通過其自身的內(nèi)吞胞吐循環(huán)過程在細胞質(zhì)與細胞膜之間進行快速地穿梭，該內(nèi)吞胞吐循環(huán)過程對腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互作用及腫瘤細胞的遷移運動起到了關(guān)鍵促進作用。我們前期研究還發(fā)現(xiàn)αvβ6的β6亞基可直接與細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2(ERK2)連接，該直接連接可活化ERK2下游相關(guān)信號通路并進一步通過介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達而促進腫瘤細胞的侵襲。此外，整合素β6還可以通過與

6、SDF-1及IL-8等趨化因子協(xié)同作用，共同促進腫瘤細胞的器官靶向轉(zhuǎn)移。在腫瘤組織中特異性表達的特性及其在促進腫瘤惡行進展過程中發(fā)揮的重要作用使得整合素β6成為一個腫瘤診斷與治療的潛在靶點。但是，作為在多種消化道惡性腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用的重要分子，整合素β6在膽管癌中的表達情況及作用機制仍然不得而知。
　　Rac蛋白屬于Rho家族小GTP酶的重要成員之一，該家族成員包括Rac1，Rac2，Rac3和Rac1b。目前為止對于該家族成員

7、的相關(guān)研究多集中于Rac1方面。Rac1可作為細胞表面受體下游的關(guān)鍵分子，通過調(diào)控多種信號通路而維持細胞的各項正常生理功能。研究發(fā)現(xiàn)Rac1在包括胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等多種消化道腫瘤組織中表達升高或活性增強，表達上調(diào)及活化后的Rac1參與了腫瘤細胞惡性生物學(xué)行為的多個方面，如腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。其中Rac1對腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵促進作用使其成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。該作用涉及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的多個重要環(huán)節(jié)，如細

8、胞偽足的形成、細胞與細胞之間的結(jié)合、細胞與ECM之間的結(jié)合、ECM中膠原成分的水解等?，F(xiàn)階段研究證實了Rac1在多種膽管癌細胞系中均為高表達，且Rac1對于膽管癌細胞腫瘤微環(huán)境的形成、化療耐藥等過程起到至關(guān)重要的作用，但有關(guān)Rac1促進膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及相應(yīng)機制目前為止仍知之甚少。
　　為了明確整合素β6在膽管癌中的表達情況及作用機制，為以β6為靶點設(shè)計合成抗腫瘤藥物提供研究基礎(chǔ)與理論支持，本文從以下四個方面進行了研究論證。(

9、1)收集了山東大學(xué)齊魯醫(yī)院共95例膽管癌患者的病理組織標本及相應(yīng)臨床資料，通過免疫組化的方式檢測了整合素β6在膽管癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達情況，分析了β6表達情況與患者臨床病理特征的關(guān)系，并進一步利用ROC分析明確了β6可作為膽管癌診斷的一個免疫組化指標，且β6表達情況可有效預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。(2)隨后通過一系列體外實驗證實β6能夠顯著促進膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。(3)進一步實驗我們從多個角度研究發(fā)現(xiàn)β6是通過活化Rac1，

10、進而增加F-actin的聚合及MMP-9的分泌而促進膽管癌細胞的遷移侵襲。(4)最后，我們利用裸鼠皮下成瘤動物模型進一步驗證了β6促進腫瘤發(fā)展的結(jié)論。通過本項目研究我們發(fā)現(xiàn)了整合素β6在腫瘤發(fā)展過程中作用的一個關(guān)鍵靶點——Rac1，鑒于Rac1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到的關(guān)鍵作用，提示針對性地干預(yù)β6將有望減少膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移，對于膽管癌患者的綜合治療具有十分重要的臨床意義和應(yīng)用前景。
　　第一部分：整合素β6在膽管癌組織中的表達情

11、況及臨床病理特征的研究
　　目的：
　　明確整合素β6在膽管癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達情況，分析β6表達與患者各項臨床病理特征的聯(lián)系，探究整合素β6表達狀況的臨床病理學(xué)意義。
　　方法：
　　1.收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院于2006-2013年期間手術(shù)切除的膽管癌腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織病理標本，并采集了相關(guān)臨床資料，采集的資料包括性別與年齡等一般資料，血清CA19-9水平，血清CEA水平，術(shù)后病理信息（包括浸潤深度、

12、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化情況等）及遠處轉(zhuǎn)移情況等。
　　2.在患者家屬知情同意的基礎(chǔ)上，采用免疫組織化學(xué)(IHC)的方法從蛋白水平檢測膽管癌腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織中β6的表達情況，并邀請兩名病理學(xué)家進行免疫組化評分，結(jié)合相關(guān)臨床病理學(xué)參數(shù)，利用卡方檢驗將量化的免疫組化評分結(jié)果進行統(tǒng)計分析。
　　3.根據(jù)統(tǒng)計學(xué)結(jié)果進一步利用ROC曲線分析β6作為膽管癌組織免疫組化指標及預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性與特異性。
　　結(jié)果：

13、　　1.研究共收集95例膽管癌組織標本及其相應(yīng)的癌旁組織標本，免疫組化結(jié)果顯示整合素β6在膽管癌組織中呈中-高程度表達，其表達位置主要位于細胞膜，胞漿中也可見少量表達，而在相應(yīng)的癌旁組織中整合素β6幾乎不表達。
　　2.β6的表達情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.0003)、遠處轉(zhuǎn)移(P=0.0126)密切相關(guān)，而與年齡、性別、血清CA19-9與CEA水平、浸潤深度及腫瘤分化情況無關(guān)(P＞0.05)。
　　3.ROC分析膽管癌與癌旁

14、組織β6表達情況的結(jié)果表明，β6高表達時其可作為膽管癌診斷的免疫組化標記（曲線下面積AUC=0.876，P＜0.001），其敏感性與特異性分別為78.95％、93.68％。ROC分析伴或不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膽管癌患者腫瘤組織中整合素β6表達情況的結(jié)果表明，當腫瘤組織免疫組化評分＞5分時可有效預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(AUC=0.701，P＜0.001)，其敏感性與特異性分別為77.55％及63.04％。
　　結(jié)論及意義：
　　整合素β6

15、在膽管癌組織中表達明顯上調(diào)，且其表達情況與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。整合素β6可以作為診斷膽管癌的免疫組化標記物，且當腫瘤組織β6表達的免疫組化評分＞5時，患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性大。故我們建議膽管癌手術(shù)切除標本常規(guī)行β6免疫組化染色，在輔助診斷膽管癌的同時，可用來預(yù)測患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況以及推斷腫瘤的惡性程度。該部分結(jié)果提示整合素β6可能在膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，為進一步探討整合素β6對膽管癌細胞惡行生物學(xué)行

16、為的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)。
　　第二部分：整合素β6對膽管癌細胞惡性生物學(xué)行為的研究
　　目的：
　　在確定整合素β6在膽管癌組織中表達明顯上調(diào)且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)后，明確整合素β6對膽管癌細胞的活性、增殖能力、遷移及侵襲能力等惡性生物學(xué)行為的作用。
　　方法：
　　1.利用quantitative Real-time PCR、Western blot檢測兩種膽管癌細胞系RBE和QBC939

17、細胞中β6的表達情況。
　　2.分別將膽管癌細胞RBE及QBC939分為4組，對照組(NC)及β6干擾組(siβ6);空白質(zhì)粒對照組(Mock)及β6過表達組(β6 transfectant)。分別利用quantitative Real-time PCR及Western blot在mRNA水平及蛋白水平檢測干擾效果及過表達效果。
　　3.采用CCK8法檢測干擾或過表達整合素β6后膽管癌細胞RBE和QBC939活性的變化。

18、r>　　4.采用MTT法檢測干擾或過表達整合素β6后膽管癌細胞RBE和QBC939增殖能力的變化情況。
　　5.利用細胞劃痕實驗及Transwell實驗檢測上述各組膽管癌細胞遷移能力的差異。
　　6.利用預(yù)先包被Matri-gel的Transwell侵襲小室檢測干擾或過表達整合素β6后膽管癌細胞侵襲能力的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.膽管癌細胞RBE及QBC939在mRNA水平和蛋白水平均中度表達β6，siβ6

19、可顯著降低兩種細胞中整合素β6的表達，而轉(zhuǎn)染整合素β6過表達質(zhì)粒后可在mRNA及蛋白水平上檢測到β6表達明顯升高。
　　2.CCK8實驗表明干擾β6表達后，兩種膽管癌細胞系細胞活性受到明顯抑制，而過表達β6后，細胞活性顯著增加。
　　3.MTT實驗證實，干擾整合素β6表達可顯著抑制膽管癌細胞的增殖能力，反之過表達整合素β6則可促進膽管癌細胞的增殖。
　　4.細胞劃痕與Transwell實驗結(jié)果表明，干擾整合素β6表達可

20、顯著抑制膽管癌細胞的遷移能力，而過表達整合素β6可促進膽管癌細胞的遷移。
　　5.利用預(yù)先包被Matri-gel的Transwell小室我們發(fā)現(xiàn)干擾整合素β6表達后，膽管癌細胞的侵襲能力顯著降低，而過表達整合素β6可明顯提高膽管癌細胞的侵襲能力。
　　結(jié)論及意義：
　　本部分內(nèi)容旨在研究整合素β6對膽管癌細胞各項惡行生物學(xué)行為的影響。首先明確了 RBE與QBC939兩種細胞系中在mRNA水平及蛋白水平均有中等量β6的表

21、達，故進一步均對兩種細胞進行了β6干擾及過表達處理，隨后利用CCK8、MTT、細胞劃痕及Transwell實驗探究了β6對這兩種膽管癌細胞的活性、增殖能力、遷移及侵襲能力的影響。本部分實驗結(jié)果表明，整合素β6可以顯著促進膽管癌細胞的活性、增殖能力、遷移能力及侵襲能力。該部分研究豐富了膽管癌發(fā)生發(fā)展的理論基礎(chǔ)，也補充了整合素β6對在膽管癌作用研究方面的空白，并為進一步探究整合素β6促進膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體機制研究打下了基礎(chǔ)。
　　第

22、三部分：整合素β6通過活化Rac1促進膽管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移
　　目的：
　　研究發(fā)現(xiàn)Rac1是腫瘤發(fā)生發(fā)展尤其是侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵分子，在組織學(xué)及細胞學(xué)實驗確定整合素β6與膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)后，探究整合素β6是否通過Rac1通路促進膽管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　方法：
　　1.干擾或過表達β6后，PAK-PBD pull down實驗檢測細胞Rac1的活性。
　　2.利用不同濃度的Rac1抑制劑處理膽管癌細

23、胞RBE及QBC939，隨后檢測處理后膽管癌細胞遷移能力和侵襲能力的變化情況。
　　3.膽管癌細胞RBE及QBC939利用50μM的NSC23766處理后，分別轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒及β6過表達質(zhì)粒，Transwell檢測兩種膽管癌細胞遷移能力和侵襲能力的變化情況。
　　4.膽管癌細胞RBE及QBC939均分為四組，分別共轉(zhuǎn)染對照(NC)/Rac1小干擾RNA(siRac1)及空白質(zhì)粒(Mock)/β6過表達質(zhì)粒(β6 transfe

24、ctant)，Transwell實驗檢測上述不同處理對膽管癌細胞遷移能力和侵襲能力的影響。
　　5.Real-time PCR實驗及ELISA實驗分別檢測干擾或過表達β6后兩種膽管癌細胞中及細胞上清中uPA，MMP2，MMP3，MMP9表達量的變化。
　　6.Real-time PCR實驗及ELISA實驗分別檢測干擾Rac1表達后兩種膽管癌細胞中及細胞上清中uPA，MMP2，MMP3，MMP9表達量的變化。
　　7.N

25、SC23766處理膽管癌細胞后，轉(zhuǎn)染β6小干擾RNA或過表達質(zhì)粒，ELISA實驗檢測膽管癌細胞上清中MMP9水平的變化。
　　8.膽管癌RBE及QBC939轉(zhuǎn)染β6小干擾RNA后，利用熒光標記的Phalloidin對細胞微絲骨架蛋白F-actin進行染色，共聚焦顯微鏡觀察膽管癌細胞中微絲骨架蛋白F-actin聚合的情況。
　　9.Rac1抑制劑處理膽管癌細胞后，轉(zhuǎn)染整合素β6小干擾RNA或過表達質(zhì)粒，利用熒光標記的Phall

26、oidin對F-actin染色，共聚焦顯微鏡觀察膽管癌細胞中F-actin聚合的情況。
　　結(jié)果：
　　1.干擾β6表達后細胞Rac1活性降低，過表達β6后細胞Rac1活性顯著增強，β6的表達對細胞中Rac1總量的表達無顯著影響。
　　2.Rac1抑制劑NSC23766可顯著抑制膽管癌細胞遷移及侵襲能力，且該抑制作用具有濃度依賴性。
　　3.過表達整合素β6后膽管癌細胞的遷移及侵襲能力顯著增強，但經(jīng)過Rac1抑制

27、劑處理后的對照組與整合素β6過表達組之間的差異消失，Rac1干擾RNA也有類似于NSC23766的效果。
　　4.Real-time PCR結(jié)果顯示，在膽管癌細胞RBE及QBC939中，干擾整合素β6的表達可顯著降低膽管癌細胞mRNA水平MMP9的表達，而uPA、MMP2及MMP3表達無明顯變化。過表達整合素β6可顯著提高膽管癌細胞MMP9在mRNA水平的表達，對uPA、MMP2及MMP3表達無顯著作用。
　　5.ELISA

28、實驗結(jié)果顯示，干擾β6可顯著降低細胞蛋白水平MMP9的表達，過表達β6可顯著提高細胞MMP9在蛋白水平的表達。
　　6.Real-time PCR結(jié)果顯示，在膽管癌細胞RBE及QBC939中，干擾Rac1的表達可顯著降低細胞mRNA水平MMP9的表達，而對uPA、MMP2及MMP3表達無明顯影響。
　　7.ELISA實驗結(jié)果顯示，干擾Rac1表達可顯著降低膽管癌細胞上清中MMP9的表達。
　　8.ELISA實驗結(jié)果顯示

29、，干擾β6可顯著降低細胞上清MMP9蛋白的表達，過表達β6可顯著提高細胞上清中MMP9蛋白的表達，但經(jīng)過NSC23766處理后，NC組與β6干擾組以及Mock組與β6過表達組之間MMP9蛋白表達的差異消失。
　　9.Phalloidin熒光染色結(jié)果顯示，NC組細胞中微絲豐富、形態(tài)規(guī)則、排列整齊，呈聚合狀態(tài)，而β6干擾后微絲出現(xiàn)了明顯的解聚。統(tǒng)計結(jié)果提示干擾整合素β6表達后可顯著促進膽管癌細胞中F-actin的解聚。
　　10

30、.Phalloidin熒光染色結(jié)果顯示，干擾β6可顯著促進膽管癌細胞中F-actin的解聚，過表達β6可顯著抑制細胞中F-actin的解聚，而經(jīng)過Rac1抑制劑NSC23766處理后，不同處理組膽管癌細胞中F-actin解聚狀態(tài)均明顯增加，且整合素β6表達狀況對F-actin解聚狀態(tài)的影響消失。
　　結(jié)論及意義：
　　本部分內(nèi)容旨在探究整合素β6促進膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體機制。首先直接證實整合素β6可以明顯增強膽管癌細胞中Ra

31、c1的活性，而對細胞Rac1表達總量無明顯影響，并利用不同濃度的Rac1抑制劑證實了Rac1在膽管癌細胞的遷移侵襲過程中發(fā)揮重要的作用，進一步利用Rac1抑制劑及特異性小干擾RNA從兩個角度證實Rac1參與了β6調(diào)控的膽管癌細胞的遷移侵襲過程。隨后我們發(fā)現(xiàn)β6可促進膽管癌細胞MMP9的表達，并進一步證實β6是通過Rac1通路發(fā)揮作用的。通過Phalloidin熒光染色我們證實β6可以顯著促進細胞骨架蛋白F-actin的聚合，且該作用也是

32、通過增強Rac1的活性而實現(xiàn)的。通過本部分實驗內(nèi)容，我們發(fā)現(xiàn)了β6促進腫瘤細胞遷移侵襲作用的一個關(guān)鍵靶點——Rac1，并證實了β6是通過活化Rac1促進F-actin的聚合及MMP9的分泌從而促進膽管癌細胞遷移侵襲的。鑒于Rac1在多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的發(fā)揮的關(guān)鍵作用，該發(fā)現(xiàn)無疑豐富了整合素β6的相關(guān)理論，并為研究整合素β6相關(guān)的靶向治療藥物來抑制膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移提供了理論基礎(chǔ)。
　　第四部分：整合素β6促進裸鼠腫瘤的生長與腫瘤組

33、織MMP9的表達
　　目的：
　　在前期體外實驗證實β6對膽管癌細胞遷移侵襲能力的促進作用及相應(yīng)機制后，體內(nèi)實驗驗證β6促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。
　　方法：
　　1.分別構(gòu)建整合素β6干擾慢病毒載體及過表達慢病毒載體;
　　2.體外培養(yǎng)已轉(zhuǎn)染整合素β6干擾慢病毒載體及過表達慢病毒載體的膽管癌細胞RBE，將其接種于裸鼠皮下建立裸鼠皮下成瘤實驗?zāi)Ｐ停闪鲞^程中測量腫瘤大小，繪制生長曲線。
　　3.處死裸鼠

34、后測量腫瘤體積與重量，并將腫瘤組織石蠟包埋后切片，免疫組化檢測腫瘤組織中整合素β6和MMP9的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.相對于對照組，整合素β6干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染組腫瘤的生長速度明顯減慢，同時腫瘤的體積和重量顯著減小;而整合素β6過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染組腫瘤的生長速度明顯加快，且腫瘤的體積和重量顯著增加。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示，相對于對照組，β6干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中β6表達顯著降低，相應(yīng)的MMP9表達

35、也明顯降低;而β6過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染組腫瘤組織內(nèi)β6表達顯著升高，相應(yīng)的MMP9表達也顯著增高。
　　結(jié)論及意義：
　　本部分是利用裸鼠皮下成瘤模型對前期體外實驗的結(jié)論進行進一步的驗證。該部分結(jié)果證實，β6不僅在體外細胞實驗中可以明顯促進膽管癌細胞的遷移侵襲，在體內(nèi)實驗中也可以明顯促進裸鼠皮下腫瘤組織的生長，同時也可以增加腫瘤組織內(nèi)MMP9的表達，提示高表達整合素β6的腫瘤組織有更強的侵襲轉(zhuǎn)移能力。通過該部分研究我們進一步