過表達(dá)BUB1B對前列腺癌進(jìn)展的影響及其預(yù)測不良預(yù)后.pdf

1、研究背景及目的：前列腺癌（PCa）是原發(fā)于前列腺的惡性腫瘤，根據(jù)2012年的全球腫瘤調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌的發(fā)病數(shù)僅次于肺癌，在全世界居第二位，而死亡率居第五位。在我國，前列腺癌的發(fā)病率在男性腫瘤中居第七位，在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中僅次于膀胱癌。如同其他腫瘤一樣，前列腺癌在本質(zhì)上也是由于基因異常而引起的疾病。參與前列腺癌的分子生物學(xué)過程很多，主要包括血管生成、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤干細(xì)胞、生長因子、炎癥因子等。
　　腫瘤標(biāo)記物是指由腫

2、瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，或者受腫瘤刺激后機(jī)體其他細(xì)胞、組織產(chǎn)生的異常表達(dá)的物質(zhì)。PSA是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的前列腺癌腫瘤標(biāo)記物，然而，血清中PSA水平受到很多因素的影響；PSA具有器官特異性，但沒有絕對的腫瘤特異性；而且，由于PSA灰區(qū)的存在，僅憑PSA檢測存在漏診或誤診前列腺癌的可能，另外目前尚未有大規(guī)模人群PSA水平的調(diào)查以明確我國PSA的參考范圍。因此，其他前列腺癌腫瘤標(biāo)記物的研究也一直在進(jìn)行中。
　　細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成

3、開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，包括間期和分裂期兩個階段。在有絲分裂過程中，母代細(xì)胞必須正確將染色體分給兩個子代細(xì)胞，錯誤的分配會導(dǎo)致非整倍體細(xì)胞的出現(xiàn)，這是腫瘤發(fā)生的一個重要生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　BUB1B，全稱是BUB1有絲分裂檢查點絲/蘇氨酸激酶B（BUB1 mitotic checkpointserine/threonine kinase B），它是參與細(xì)胞周期的一個重要基因。已經(jīng)有一些關(guān)于BUB1B在腫瘤中的報道，但在前

4、列腺癌中的報道很少。首先通過文獻(xiàn)檢索、數(shù)據(jù)庫分析、生物信息學(xué)軟件分析、生存分析等，確定了BUB1B作為本課題的研究對象，進(jìn)一步研究BUB1B在前列腺癌中的作用及其對預(yù)后的影響。
　　材料和方法：
　　1、用于免疫組化的組織芯片購買于上海芯超生物科技有限公司；Taylor數(shù)據(jù)庫的全部內(nèi)容可經(jīng)由網(wǎng)址進(jìn)行下載。本實驗中，應(yīng)用到的三種前列腺癌細(xì)胞株（PC3、DU145、LNCaP）以及一種良性前列腺細(xì)胞株（BPH-1），均購買自廣州

5、萊德爾生物科技有限公司。
　　2、通過 qRT-PCR和 WB分別檢測前列腺癌細(xì)胞株以及前列腺增生細(xì)胞株的BUB1B表達(dá)情況。利用免疫組化技術(shù)和公開數(shù)據(jù)庫，分析 BUB1B的蛋白水平和mRNA水平在前列腺癌組織及對照良性前列腺組織中的表達(dá)情況。
　　3、構(gòu)建 BUB1B過表達(dá)的質(zhì)粒，以及抑制表達(dá)的 siRNA，轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得相應(yīng)前列腺癌細(xì)胞株。通過細(xì)胞功能實驗，研究BUB1B基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等

6、功能的影響情況。
　　4、通過分析組織芯片和Taylor數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，研究BUB1B的表達(dá)與臨床病理數(shù)據(jù)的關(guān)系，如PSA水平、Gleason評分、是否生化復(fù)發(fā)等。
　　5、通過生存曲線分析，研究 BUB1B的表達(dá)與總體生存率、無生化復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系。通過 Cox回歸分析，研究 BUB1B及其它指標(biāo)對前列腺癌總體生存及無生化復(fù)發(fā)生存的影響，是否可以作為預(yù)后的預(yù)測因子。
　　6、通過生物信息學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，得到與BUB1

7、B相關(guān)性較大的一組基因，分析其生物信息學(xué)特點，主要參與了哪些細(xì)胞過程、哪些分子通路。
　　7、統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。連續(xù)變量以X?s的形式顯示。qRT-PCR、免疫組化、Western blot和細(xì)胞功能實驗等定量結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析采用兩獨立樣本t檢驗。多組樣本的比較采用方差分析。Kolmogorov-Smirnov(K-S)檢驗用于評估 Taylor數(shù)據(jù)庫中 BUB1B芯片值分布是否為正態(tài)分布

8、。Kaplan-Meier方法及l(fā)og-rank檢驗用于生存分析，Cox比例風(fēng)險回歸模型分析用于單因素和多因素分析BUB1B是否能作為預(yù)測前列腺癌預(yù)后的獨立指標(biāo)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、BUB1B在前列腺增生和前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，PC3、DU145和LNCaP細(xì)胞中BUB1B的mRNA水平分別是BPH-1細(xì)胞的(3.204±0.44)、(5.119±0.33)、(

9、2.446±0.79)倍，P值分別為0.025，0.013和0.037。WB結(jié)果顯示，BUB1B蛋白水平的表達(dá)在前列腺癌細(xì)胞中高于前列腺增生細(xì)胞；但蛋白水平在三種前列腺癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差別不大。結(jié)果說明，前列腺癌細(xì)胞中的BUB1B表達(dá)高于良性前列腺細(xì)胞。
　　2、抑制表達(dá)BUB1B對前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響。抑制表達(dá)BUB1B后，在DU145細(xì)胞中，siBUB1B組的mRNA水平為對照組的(25.83±23.0)％，

10、蛋白水平為對照組的(15.73±9.36)%；在LNCaP細(xì)胞中，siBUB1B組的 mRNA水平為對照組的(68.30±29.0)%，蛋白水平為對照組的(43.56±21.48)%，P值分別為0.020、0.013和0.037、0.026，均<0.05，說明轉(zhuǎn)染成功、轉(zhuǎn)染效率可。
　　細(xì)胞增殖實驗（CCK8實驗）顯示，在DU145細(xì)胞中，在24、48和72小時組中，對照組和siBUB1B組的OD值分別為：(0.177±0.013

11、) vs.(0.173±0.013)，P=0.754；(0.374±0.034) vs.(0.431±0.036)，P=0.178；(0.645±0.035) vs.(0.592±0.006)，P=0.272；在LNCaP細(xì)胞中，在24、48和72小時組中，對照組和siBUB1B組的OD值分別為(0.301±0.029) vs.(0.230±0.058)，P=0.062；(0.519±0.038) vs.(0.442±0.017)，P=

12、0.053；(0.724±0.026) vs.(0.653±0.021)，P=0.073，P值均大于0.05，兩組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，說明抑制表達(dá)BUB1B對前列腺癌細(xì)胞增殖功能沒有影響。
　　細(xì)胞遷移能力實驗（劃痕實驗）顯示，在DU145細(xì)胞中，72h時對照組和siBUB1B組的細(xì)胞數(shù)量分別為(100.9±22.8) vs.(101.3±13.0)，P=0.947；進(jìn)一步分析24、48和72h時對照組和實驗組細(xì)胞數(shù)量，三個

13、時間點兩組細(xì)胞數(shù)量的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義。在LNCaP細(xì)胞中，6、12、24和48h時對照組和實驗組細(xì)胞數(shù)量，四個時間點兩組細(xì)胞數(shù)量的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義，說明BUB1B的抑制表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞的遷移能力沒有影響。
　　細(xì)胞侵襲能力實驗（Transwell實驗）顯示，在DU145細(xì)胞中，48h后兩組穿膜細(xì)胞數(shù)量差異的P值為0.457；在LNCaP細(xì)胞中，48h后兩組穿膜細(xì)胞數(shù)量差異的P值為0.001，但是兩者的差值相差大約20%左

14、右，提示抑制表達(dá) BUB1B對 LNCaP細(xì)胞的侵襲能力有影響，但這種影響相對而言比較輕微。
　　3、過表達(dá)BUB1B對前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響。過表達(dá)BUB1B后，在mRNA水平，相對于對照組，在DU145細(xì)胞中，實驗組的 BUB1B相對表達(dá)量為（1.723±0.178）倍；在 LNCaP細(xì)胞中，實驗組的 BUB1B相對表達(dá)量為（1.683±0.057）倍，P值分別為0.035和0.031，蛋白水平也有類似結(jié)果，

15、說明轉(zhuǎn)染成功、轉(zhuǎn)染效率可。
　　細(xì)胞增殖實驗（CCK8實驗）顯示，在DU145細(xì)胞中，在24、48和72h時，對照組的 OD值分別為(0.218±0.016)、(0.484±0.031)和(0.594±0.025)，而實驗組的 OD值則分別為(0.313±0.036)、(0.636±0.040)和(0.907±0.030)，P值分別為0.014、0.035和0.001；在LNCaP細(xì)胞中，在24、48和72h時，對照組的OD值分別

16、為(0.292±0.035)、(0.513±0.037)、(0.719±0.043)，而實驗組的OD值分別為(0.415±0.065)、(0.709±0.032)、(1.015±0.034)，P值分別為0.044、0.002和0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明前列腺癌細(xì)胞過表達(dá)BUB1B之后其細(xì)胞增殖能力增加。
　　細(xì)胞遷移能力實驗（劃痕實驗）顯示，在DU145細(xì)胞中，24、48和72h時實驗組和對照組差異的P值均小于0.001；

17、在LNCaP細(xì)胞中，6、12、24和48h時實驗組和對照組差異的P值均小于0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明過表達(dá)BUB1B對前列腺癌細(xì)胞的遷移能力有影響，能夠提高前列腺癌細(xì)胞的遷移能力。
　　細(xì)胞侵襲能力實驗（Transwell實驗）顯示，在DU145細(xì)胞中，48h后兩組穿膜細(xì)胞數(shù)量差異的P值<0.001；在LNCaP細(xì)胞中，48h后兩組穿膜細(xì)胞數(shù)量差異的P值為0.001，說明過表達(dá)BUB1B的前列腺癌細(xì)胞能夠增加其侵襲能力。

18、r>　　4、BUB1B在人類良性前列腺增生和前列腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理數(shù)據(jù)的關(guān)系。組織芯片免疫組化評分顯示，良性組織的BUB1B平均評分為3.53±1.43，而惡性組織的平均評分為4.18±1.83，P值為0.011。將Gleason評分按照傳統(tǒng)的低危（<7）、中危（=7）、高危（>7）進(jìn)行分組，研究每組組內(nèi)BUB1B高表達(dá)（組化評分大于等于4分）及低表達(dá)（組化評分小于4分）所占的比例，統(tǒng)計學(xué)分析顯示P=0.039，說明三組之間

19、高表達(dá) BUB1B的比例不同。從以上數(shù)據(jù)我們認(rèn)為，前列腺腫瘤組織中BUB1B的表達(dá)高于良性前列腺組織；而且，隨著前列腺腫瘤組織惡性程度的提高， BUB1B的表達(dá)也進(jìn)一步提高，BUB1B可能與前列腺癌的惡性程度呈正相關(guān)。
　　在Taylor數(shù)據(jù)庫中，前列腺腫瘤組織中BUB1B的表達(dá)（5.54±0.31）高于前列腺良性組織（5.30±0.12），P<0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在高PSA水平（≥10 ng/ml）、高Gleason評

20、分、存在轉(zhuǎn)移、最終死亡以及存在生化復(fù)發(fā)的前列腺癌患者中，BUB1B的表達(dá)高于在低PSA水平、低Gleason評分、無轉(zhuǎn)移、存活以及無生化復(fù)發(fā)的患者， P值分別為0.038、0.016、<0.001、0.006和0.003，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5、BUB1B與臨床預(yù)后的關(guān)系。單因素分析顯示， BUB1B是前列腺癌患者無生化復(fù)發(fā)生存的獨立預(yù)測因子，其風(fēng)險比（OR）值為3.482，P=0.001，提示是一個不良預(yù)后的指標(biāo)。多因素分析

21、也顯示同樣的結(jié)果，OR值為2.209，P=0.045。然而，對于總體生存而言，無論是單因素分析（OR=1.947，P=0.273）還是多因素分析（OR=1.690，P=0.676），BUB1B都不是總體生存的獨立預(yù)測因子。
　　生存分析顯示，高表達(dá)和低表達(dá) BUB1B的前列腺癌患者的總體生存沒有差別（P=0.099），而BUB1B高表達(dá)組的患者其生化復(fù)發(fā)率高于BUB1B低表達(dá)組的患者， P<0.001，說明BUB1B的高表達(dá)可能是

22、生化復(fù)發(fā)的一個危險因素。
　　6、BUB1B的生物信息學(xué)分析及其可能的作用機(jī)制探究。通過Taylor數(shù)據(jù)庫分析，通過相關(guān)性分析，獲得了166個在前列腺癌中與BUB1B呈正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)不低于0.5的基因；同時獲得了44個與BUB1B呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)小于-0.5的基因。這些基因的功能主要集中在細(xì)胞周期相關(guān)的生物學(xué)過程中，例如有絲分裂、著絲點、DNA損傷及修復(fù)等。這些基因參與的細(xì)胞過程也集中在細(xì)胞周期、細(xì)胞通訊、細(xì)胞成分運動、染色

23、體分離等方面，大多是和有絲分裂相關(guān)的細(xì)胞過程。這些基因參與的通路主要包括：p53通路、Wnt信號通路、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期等。
　　結(jié)論：
　　1、BUB1B的高表達(dá)可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，說明BUB1B起著前列腺癌促癌基因的作用。
　　2、BUB1B在前列腺癌中表達(dá)升高，根據(jù)其在組織中的表達(dá)差異，可以鑒別良性前列腺組織和前列腺癌。
　　3、BUB1B的表達(dá)強(qiáng)度與前列腺癌惡性程度呈正相關(guān)，檢測BU