重組鹽生杜氏藻雙功能域3-磷酸甘油脫氫酶的表達(dá)純化和部分酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、鹽生杜氏藻Dunaliella salina(簡(jiǎn)稱鹽藻)是一種抗鹽能力很強(qiáng)的單細(xì)胞綠藻，具有極強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力。甘油是它的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。杜氏藻細(xì)胞內(nèi)有一條專門的調(diào)節(jié)滲透壓的代謝途徑，即甘油循環(huán)代謝途徑，它能對(duì)外界鹽濃度變化作出迅速反應(yīng)，調(diào)節(jié)胞內(nèi)甘油濃度以使細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到滲透平衡。3-磷酸甘油(G-3-P)脫氫酶是甘油循環(huán)中的第一個(gè)酶，在其中起重要的調(diào)節(jié)作用。因此研究杜氏藻G-3-P脫氫酶的性質(zhì)具有重要意義。 實(shí)驗(yàn)室在前期工作中

2、已獲得鹽藻Osm-GPD的全長基因，生物信息學(xué)分析表明該基因結(jié)構(gòu)相對(duì)于其它物種的GPD基因而言非常特殊，即同時(shí)具有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：GPD Domain和SGPP Domain。本研究在對(duì)具有雙功能域的重組鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶的表達(dá)條件優(yōu)化和純化的基礎(chǔ)上，對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。 1、表達(dá)條件的優(yōu)化 通過降低誘導(dǎo)溫度和改變誘導(dǎo)劑濃度濃度的方法;在30℃，O.3mmol/LIPTG的條件下，誘導(dǎo)工程菌株BL2l(DE

3、3)/pET32-GPD1.9，目的蛋白質(zhì)重組鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶以可溶蛋白的形式存在于上清中。 2、重組鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶的純化 將酶粗提液經(jīng)Chelating F.F.金屬螯合層析，透析，腸激酶酶切，ChelatingH.P．金屬螯合層析等步驟，分離純化了重組3-磷酸甘油脫氫酶，SDS-PAGE結(jié)果都顯示出一條帶，GPD(逆向)比活性為192U/mg，GPP比活性為4440U/mg；SDS-聚丙烯酰

4、胺凝膠電泳測(cè)得相對(duì)分子質(zhì)量為60KDa。 3、酶活性影響因素的測(cè)定 重組3-磷酸甘油脫氫酶GPD功能域逆向酶活性的最適溫度為37℃，最適pH為10.0；GPP功能域酶活性的最適溫度50℃，最適pH為7.0；關(guān)于鹽對(duì)該酶的活性影響。低濃度的NaCI(0.05 mol／L)對(duì)重組3-磷酸甘油脫氫酶活力略有保護(hù)作用。但高濃度NaCl(0.15 mol/L，0.5 mol/L)對(duì)酶有一定的抑制作用，并能加快酶的失活，而且濃度越高

5、效應(yīng)越明顯，含0.5mol/L NaCI的酶液保存2 d活力全部喪失。 4、重組3-磷酸甘油脫氫酶動(dòng)力學(xué)研究 通過動(dòng)力學(xué)方法測(cè)得重組3-磷酸甘油脫氫酶GPD功能域在25℃，pH為10.0條件下，以3-磷酸甘油和NAD<'+>為底物，Km (G3P)為4.21mmol/L Km(NAD<'+>)為2.57mmol/L。重組3-磷酸甘油脫氫酶GPP功能域在25℃，pH為7.0條件下，以3-磷酸甘油為底物，Km(G3P)為1.