氧化應(yīng)激在間歇低氧致海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷中自噬變化的機(jī)制研究.pdf

1、目的:阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）是最常見的睡眠呼吸障礙，神經(jīng)認(rèn)知功能障礙是其常見的并發(fā)癥之一。其發(fā)生可能與OSAHS的特征性病理生理學(xué)改變間歇低氧有關(guān)。間歇低氧可導(dǎo)致大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞不同程度損傷，如細(xì)胞凋亡、炎性損傷等。自噬作為真核細(xì)胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)，與缺血/缺氧所致的細(xì)胞損傷存在一定的聯(lián)系。我們前期研究已證實自噬可能同樣參與了間歇低氧所致的海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，但其機(jī)制尚不清楚。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是間歇低氧所

2、致各系統(tǒng)損傷的病理機(jī)制之一，也是細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生的重要原因。因此，我們推測氧化應(yīng)激可能介導(dǎo)了間歇低氧致海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷中自噬的變化。本研究即通過模擬OSAHS建立間歇低氧模型，從體外水平研究觀察間歇低氧及抗氧化干預(yù)對海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬強(qiáng)度、活性氧水平及細(xì)胞損傷程度的影響，探討氧化應(yīng)激在間歇低氧致海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷中自噬發(fā)生變化的作用及機(jī)制。
　　方法:取出生24h內(nèi)的SD乳鼠，分離海馬組織，接種細(xì)胞懸液進(jìn)行原代海馬神經(jīng)細(xì)胞培

3、養(yǎng)，通過光學(xué)顯微鏡分別觀察細(xì)胞培養(yǎng)第1、3、5、7天海馬神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。①將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：正常對照組、間歇低氧4h組、間歇低氧8h組、間歇低氧12h組，應(yīng)用間歇低氧模式（循環(huán)給予：常氧為21％ O2，5%CO2和平衡N2，持續(xù)10min；低氧為1.5% O2，5% CO2和平衡N2，持續(xù)5min，一次循環(huán)15min）處理各間歇低氧組海馬神經(jīng)細(xì)胞，建立4h、8h、12h三個時間點的間歇低氧細(xì)胞模型，正常對照組持續(xù)給予21%的常氧

4、。通過免疫熒光法檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞膜標(biāo)記蛋白MAP-2的表達(dá)，進(jìn)行原代海馬神經(jīng)細(xì)胞鑒定。通過免疫印跡法和免疫熒光法檢測各組海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白 LC3-II、Beclin1的表達(dá)，DCF免疫熒光法檢測各組海馬神經(jīng)細(xì)胞ROS水平，TUNEL法檢測各組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率；②將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：正常對照組、間歇低氧組、抗氧化干預(yù)組、間歇低氧+抗氧化干預(yù)組，給予細(xì)胞N-乙酰半胱氨酸（NAC）抗氧化干預(yù)處理，選取ROS及自噬表達(dá)變化最明顯的間歇

5、低氧時間點12h進(jìn)行間歇低氧處理，建立N-乙酰半胱氨酸（NAC）抗氧化干預(yù)的間歇低氧細(xì)胞模型，正常對照組及單純抗氧化干預(yù)組分別持續(xù)給予21%的常氧。通過免疫印跡法和免疫熒光法檢測各組海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白 LC3-II及 cleaved-caspase-3的表達(dá)，DCF免疫熒光法檢測各組海馬神經(jīng)細(xì)胞ROS水平，TUNEL法檢測各組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:①原代海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的光鏡觀察圖與鑒定：光鏡下可見第1天細(xì)胞出現(xiàn)分

6、支及雙極突起，第3天細(xì)胞胞體增大，突起向外延伸，部分細(xì)胞聚集成簇生長，至第5-7天，細(xì)胞胞體成熟飽滿，突起粗壯可交織成網(wǎng)；免疫熒光檢測MAP-2結(jié)果顯示，海馬神經(jīng)細(xì)胞其胞體和突起呈現(xiàn)MAP-2表達(dá)的紅色熒光。②間歇低氧不同時間點海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬、ROS表達(dá)及凋亡的檢測：免疫印跡及免疫熒光法檢測結(jié)果顯示，隨著間歇低氧時間延長，自噬標(biāo)記蛋白 LC3-II、Beclin1的表達(dá)也逐漸增高，間歇低氧12h組表達(dá)較正常對照組顯著增高，差異具有統(tǒng)計

7、學(xué)意義（P<0.05）；DCF免疫熒光法檢測結(jié)果顯示，隨著間歇低氧時間延長，海馬神經(jīng)細(xì)胞ROS表達(dá)也逐漸增高，間歇低氧12h組表達(dá)較正常對照組顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；TUNEL法檢測結(jié)果顯示，隨著間歇低氧時間延長，細(xì)胞凋亡率也逐漸增高，間歇低氧12h組較正常對照組顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。③抗氧化干預(yù)間歇低氧處理后海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬、ROS表達(dá)及凋亡的檢測：免疫印跡及免疫熒光法檢測結(jié)果顯示，間歇低

8、氧組自噬標(biāo)記蛋白LC3-II的表達(dá)較正常對照組顯著增高，間歇低氧+抗氧化干預(yù)組自噬標(biāo)記蛋白 LC3-II的表達(dá)較間歇低氧組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；DCF免疫熒光法檢測結(jié)果顯示，間歇低氧組海馬神經(jīng)細(xì)胞 ROS表達(dá)較正常對照組顯著增高，間歇低氧+抗氧化干預(yù)組 ROS表達(dá)較間歇低氧組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，間歇低氧組 cleaved-caspase-3的表達(dá)較正常對照組顯著增

9、高，間歇低氧+抗氧化干預(yù)組cleaved-caspase-3的表達(dá)較間歇低氧組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；TUNEL法檢測結(jié)果顯示，間歇低氧組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較正常對照組顯著增高，間歇低氧+抗氧化干預(yù)組細(xì)胞凋亡率較間歇低氧組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論:本研究證實：①ROS可能參與了間歇低氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬的改變；②抗氧化干預(yù)可減輕間歇低氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬以及細(xì)胞凋亡。綜