microRNA-182對大鼠肝再生的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、為了解microRNA(miRNA)對肝細胞增殖和肝再生的調(diào)節(jié)作用，本文用microRNAs(miRNAs)高通量測序方法檢測大鼠再生肝肝組織中的miRNAs表達差異性發(fā)現(xiàn)，microRNA-182(miR-182)等129種miRNAs的表達顯著上調(diào)。用qRT-PCR檢測其中肝再生相關miRNA在大鼠再生肝中表達變化發(fā)現(xiàn)，miR-21，miR-21*，miR-125a, miR-142，miR-143,miR-181c,miR-182

2、,miR-183,miR-191,miR-199a, miR-429等11條miRNAs的表達趨勢與高通量測序結果基本吻合。結合文獻報道和預測的靶基因的功能分析，本實驗室前期選擇以miR-182為研究對象，對其生物學功能進行體外研究，結果發(fā)現(xiàn)，用miR-182的模擬物和抑制物轉染大鼠正常肝細胞系BRL-3A時，與陰性對照相比，其模擬物顯著促進肝細胞增殖，它的抑制物顯著抑制肝細胞增殖。用雙熒光素酶(Dual-Lucifersae)報告系統(tǒng)

3、檢測表明，miR-182可直接與半胱天冬酶3（caspase3）的mRNA3'端不編碼區(qū)(3'UTR)結合，說明caspase3是miR-182的靶基因之一，caspase3是執(zhí)行凋亡的蛋白，因此我們推測miR-182通過抑制其靶基因caspase3促進大鼠正常肝細胞系BRL-3A的增殖。
　　為進一步檢測miR-182對大鼠肝再生的調(diào)節(jié)作用，我們構建了miR-182的過表達質(zhì)粒和干涉質(zhì)粒，用大鼠尾靜脈液壓轉基因技術分別將miR-

4、182的過表達質(zhì)粒microRNA-182-C1和干涉質(zhì)粒microRNA-182-SC1轉入大鼠肝臟，首先檢測質(zhì)粒的熒光蛋白的表達動態(tài)，其次檢測目的基因miR-182的表達，通過摸索最佳的轉基因方式，成功的建立了最佳的轉基因模式，檢測肝系數(shù)發(fā)現(xiàn):轉入microRNA-182-C1的實驗組在PH72和PH120h時，肝系數(shù)顯著高于對照的肝系數(shù);PH后168h時與對照無顯著差異。而轉入microRNA-182-SC1的實驗組在PH后168

5、h時，肝系數(shù)顯著低于對照，表明miR-182的過表達可以促進大鼠肝再生，而當干涉miR-182的表達時，大鼠肝再生無法如期完成。用qRT-PCR與Western blot方法檢測miR-182處理后再生肝中的9個與細胞增殖、凋亡、存活相關基因與蛋白的表達變化發(fā)現(xiàn):在上述再生肝組織中，miR-182對相關基因發(fā)生改變?yōu)? PH后72h時，caspase3、TNFRS1A、SMAD7、MAPK9上調(diào)，WNT4下調(diào)。PH后120h時，casp

6、ase3、TNFRS1A、TGFBR1、WNT4、MAP3K12、SMAD7、MAPK9、MAP2K1上調(diào)。PH后168h時，BCL2、TNFRS1A、TGFBR1、WNT4上調(diào)，caspase3、SMAD7、MAPK9下調(diào)。對相關蛋白變化的影響為-PH后72h時，WNT4、MAPK9、SMAD7、MAP3K12、MAP2K1等蛋白表達上調(diào)。PH后120h時，BCL2、WNT4、MAPK9、SMAD7、MAP3K12、MAP2K1等蛋白

7、表達上調(diào)。PH后168h時，WNT4表達上調(diào)，caspase3、TGFBR1、TNFRSF1A等蛋白表達下調(diào)，其他無有意義變化。這些結果提示PH后72-120h通過上調(diào)增殖相關基因來促進肝再生，168h時的恢復正常，主要是通過抑制增殖相關基因和促進凋亡相關基因的表達來抑制再生肝的異常增殖。
　　結合蛋白質(zhì)組學研究“大鼠肝再生中肝細胞的蛋白表達變化預示的細胞增殖活動和凋亡活動”（結果待發(fā)表）發(fā)現(xiàn)，miR-182促進MAPK、SMAD