AP2-ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控丹參活性成分生物合成的功能研究.pdf

1、丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge.)為我國常用大宗藥材，其有效成分——丹參酮和丹酚酸類化合物具有多種藥理活性，以丹參為君藥的“復(fù)方丹參滴丸”在治療心腦血管疾病方面已取得顯著療效。近年來，丹參活性成分生物合成途徑分子機(jī)制已獲得深入解析，但其生物合成的調(diào)控機(jī)制研究尚十分匱乏。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在多種藥用植物中具有調(diào)控活性成分（如倍半萜青蒿素、二萜紫杉醇等）生物合成的功能，而在丹參中調(diào)控活性成分合成的AP2/ERF

2、尚未報(bào)道。本次研究的主要研究結(jié)果如下：
　　1.本課題組已獲得丹參基因組圖譜，注釋到170個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，命名為Sm001-Sm170。本研究基于已有丹參不同器官（根、莖、葉、花）及根不同組織（周皮、韌皮部、木質(zhì)部）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，參照已鑒定參與丹參酮及丹酚酸類化合物生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)譜，篩選出兩個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，皮＜韌皮部和木質(zhì)部的規(guī)律;Sm082具有在根中顯著性高豐度表達(dá)的特點(diǎn)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

3、驗(yàn)證這兩個(gè)AP2/ERF基因的表達(dá)譜，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。構(gòu)建瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，侵染煙草葉片，分析Sm008和Sm082的亞細(xì)胞定位情況，證明兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核中。
　　2.本研究構(gòu)建了丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系，對Sm008和Sm082進(jìn)行過表達(dá)、RNAi抑制表達(dá)分析，獲取了丹參轉(zhuǎn)基因毛狀根。檢測陽性轉(zhuǎn)基因毛狀根中Sm008基因抑制表達(dá)和過表達(dá)的效率，篩選出3個(gè)抑制表達(dá)株系：8i-1/3/6;3個(gè)過表達(dá)株系：8oe-1/8/9。檢測了

4、轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹酚酸類化合物的含量變化，每個(gè)株系做三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
　　結(jié)果表明，與對照組相比，3個(gè)抑制表達(dá)株系中丹酚酸B的含量有明顯下降，同時(shí)3個(gè)過表達(dá)株系中丹酚酸B含量明顯上升。另外，觀察到Sm008轉(zhuǎn)基因毛狀根和培養(yǎng)液呈現(xiàn)丹參酮類化合物所具有的黃/紅色，所以對丹參酮的含量變化進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Sm008抑制表達(dá)的2個(gè)株系中二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的含量在毛狀根及培養(yǎng)液中均下降，說明Sm00

5、8基因可能對丹酚酸及丹參酮類化合物的生物合成均具有調(diào)控作用。進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)基因毛狀根中參與丹參酮和丹酚酸生物合成基因的表達(dá)量變化，預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控的目的基因，結(jié)果表明，Sm008可能調(diào)控的丹酚酸途徑的目的基因?yàn)?CL2基因，丹參酮途徑的目的基因?yàn)镃PS1、KSL1、CYP76AH1基因。
　　3.對于Sm082的轉(zhuǎn)基因株系，篩選出4個(gè)抑制表達(dá)株系：82i-1/5/7/19;1個(gè)過表達(dá)株系：82oe-9。化學(xué)含量分析結(jié)果表明，與對

6、照組相比，4個(gè)抑制表達(dá)株系中二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA明顯下降，過表達(dá)株系中二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮含量上升;而丹酚酸B含量在過表達(dá)及RNAi株系中均無明顯變化;說明Sm082基因?qū)Φ⑼惢衔锏纳锖铣删哂姓{(diào)控作用，對丹酚酸類化合物的生物合成不具有調(diào)控作用。分析關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量變化說明Sm082可能調(diào)控丹參酮途徑的目的基因?yàn)镃PS1、KSL1基因。本次研究還獲得了Sm082轉(zhuǎn)基因毛狀根對應(yīng)的轉(zhuǎn)基因組培苗，觀察根系及

7、葉片的熒光情況及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因組培苗依然攜帶GFP報(bào)告基因且保持了Sm082基因的抑制/過表達(dá)狀態(tài)。
　　4.構(gòu)建Sm008和Sm082基因的原核表達(dá)體系，Sm008在異源表達(dá)體系中可以表達(dá)并獲得可溶性蛋白，而Sm082在蛋白提取的上清和沉淀中均未誘導(dǎo)表達(dá)獲得蛋白。同時(shí)，我們還預(yù)測了丹參酮及丹酚酸類化合物生物合成途徑中一系列關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子區(qū)，篩選出含有GCC box的啟動(dòng)子序列并進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)克隆，已克隆到啟動(dòng)子區(qū)