鱉甲煎丸對(duì)肝癌細(xì)胞中Wnt-β-catenin信號(hào)通路信號(hào)分子及靶基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　通過(guò)采用血清藥理學(xué)研究方法，研究鱉甲煎丸對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的信號(hào)分子、靶基因及抑制因子表達(dá)水平的影響，明確鱉甲煎丸通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步探討鱉甲煎丸抗肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移侵襲的分子機(jī)制。
　　方法及內(nèi)容：
　　1.含藥血清的制備:Wistar大鼠飼養(yǎng)于室溫(21-25℃)、相對(duì)濕度50-60％、晝夜各半的環(huán)境中，普通飼料

2、喂養(yǎng)，自由飲水，32只Wistar大鼠隨機(jī)分為高劑量藥物組（H組）、低劑量藥物組（L組）、陰性對(duì)照組（NC組）、索拉菲尼陽(yáng)性對(duì)照組（P組）。H、L組分別將成人(60 kg)臨床劑量的20、10倍的鱉甲煎丸用生理鹽水溶解配制成混懸液，按10 ml/kg灌胃給藥，NC組以等量生理鹽水灌胃，P組以50 mg/kg索拉菲尼水溶液灌胃。2次/d，連續(xù)飼養(yǎng)3d，于第4天給藥2h后3％異戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置1h后，4000r/mi

3、n離心30 min分離血清，經(jīng)56℃滅活30 min，0.22μm過(guò)濾除菌后，置于-20℃凍存。
　　2.細(xì)胞培養(yǎng):肝癌細(xì)胞HepG2用10％FBS（體積分?jǐn)?shù)）的DMEM培養(yǎng)于37℃、5％CO2飽和濕度的孵箱內(nèi)，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行傳代，2.5×106/ml的密度接種于6孔板中，分為藥物血清組(H/L/NC)、索拉菲尼陽(yáng)性對(duì)照組(P組)、不含藥物血清的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組（BC組）。待細(xì)胞貼壁后吸去上清，分別依照分組加入含藥物

4、血清(10％)的培養(yǎng)液及DMEM進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　3.Western blotting及免疫熒光法檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中Wnt/β-catenin信號(hào)通路信號(hào)分子β-catenin蛋白表達(dá)水平。
　　4.Western blotting檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG2中Wnt/β-catenin信號(hào)通路信號(hào)分子GSK-3β、磷酸化GSK-3β及AKT、磷酸化AKT蛋白表達(dá)水平。
　　

5、5.熒光素酶檢測(cè)法檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG2中β-catenin/TCF4復(fù)合物的活性。
　　6.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG2中Wnt/β-catenin下游靶基因CD44v6、VEGF的表達(dá)水平。
　　7.Western blotting檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG2中Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因MMP-2的表達(dá)水平。
　　8.RT-PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG2中Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制基因

6、DKK-1、FrpHE mRNA的表達(dá)水平。
　　以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.Western blotting檢測(cè)β-catenin的表達(dá)水平:β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平:與BC組和NC組相比，H組、L組和P組的β-catenin表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，BC組和NC組之間無(wú)顯著性差異(P＞0

7、.05);β-catenin在細(xì)胞核中的表達(dá)水平:與BC組和NC組相比，H組和P組的β-catenin表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，L組、BC組和NC組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，表明鱉甲煎丸可抑制β-catenin在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中的表達(dá)，其抑制作用與藥物濃度有關(guān)。免疫熒光檢測(cè)其表達(dá)水平進(jìn)一步表明該結(jié)果。
　　2.Western blotting檢測(cè)GSK-3β、磷酸化GSK-3β的表達(dá)水平:與BC組和NC組相比，H組

8、和P組的磷酸化GSK-3β的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，L組、BC組和NC組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，各組之間GSK-3β表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P＞0.05)。表明鱉甲煎丸對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2中GSK-3β的表達(dá)無(wú)明顯影響，但能顯著降低磷酸化GSK-3β的表達(dá)水平。
　　3.Western blotting檢測(cè)AKT、磷酸化AKT的表達(dá)水平:與BC組和NC組相比，H組和P組的磷酸化AKT的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05

9、)，L組、BC組和NC組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，各組之間AKT表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P＞0.05)。表明鱉甲煎丸對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2中AKT的表達(dá)水平無(wú)明顯影響，但能顯著降低磷酸化AKT的表達(dá)水平。
　　4.熒光素酶檢測(cè)法檢測(cè)β-catenin/TCF4復(fù)合物的活性: H組、L組、P組與NC組及BC組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，表明鱉甲煎丸可抑制β-catenin/TCF4復(fù)合物的活性。H組與P組之間無(wú)顯著性差異，

10、但索拉菲尼對(duì)β-catenin/TCF4復(fù)合物活性的抑制作用強(qiáng)于鱉甲煎丸。
　　5.細(xì)胞免疫組化法檢測(cè)CD44v6、VEGF的表達(dá)水平:CD44v6及VEGF在H組、P組的表達(dá)水平與NC組、BC組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，L組與BC組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，表明鱉甲煎丸能減少肝癌細(xì)胞HepG2中CD44v6、VEGF的表達(dá)，其抑制作用與藥物血清濃度有關(guān)。
　　6.Western blotting檢測(cè)MMP

11、-2的表達(dá)水平:與NC組及BC組相比，H組、L組、P組MMP-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，表明鱉甲煎丸可顯著降低肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)MMP-2的蛋白表達(dá)水平。
　　7.RT-PCR檢測(cè)DKK-1及FrpHE mRNA表達(dá)水平: DKK-1 mRNA的表達(dá)H組＞L組＞NC組，且H組、L組與NC組和BC組之間比較有顯著性差異(P＜0.05)，說(shuō)明鱉甲煎丸能促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2中抑癌基因DKK-1的表達(dá)，且這種促進(jìn)作用和

12、藥物劑量有關(guān)。而FrpHE mRNAL組表達(dá)高于H組，H組與NC組之間無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　1.鱉甲煎丸可減少肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中β-catenin的表達(dá)，抑制β-catenin/TCF4復(fù)合物的形成及降低其活性，其機(jī)制可能與鱉甲煎丸能夠下調(diào)磷酸化AKT的表達(dá)，從而抑制AKT的活化，進(jìn)一步減少肝癌細(xì)胞HepG2中GSK-3β磷酸化，使GSK-3β降解減少，促進(jìn)了β-catenin的磷酸化，從而加快了β

13、-catenin降解有關(guān)。β-catenin在肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)的表達(dá)水平降低，使β-catenin入核減少，進(jìn)一步阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路的信號(hào)傳遞。
　　2.鱉甲煎丸可顯著降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路靶基因CD44v6、VEGF和MMP-2的表達(dá)水平，從而抑制肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移以及肝癌組織中新血管的生成。
　　3.鱉甲煎丸能夠促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制基因DKK-1的表達(dá)，進(jìn)一步