弗氏志賀菌熱休克蛋白HtrA蛋白酶功能及翻譯后修飾的研究.pdf

1、志賀菌（Shigella spp.）是一種具有高度傳染性的革蘭氏陰性腸道病原菌，兒童和農(nóng)民是易感人群。志賀菌的感染劑量極低，且存在著多重耐藥性，致使志賀菌的預(yù)防及治療存在著極大挑戰(zhàn)，針對(duì)志賀菌疫苗的研制更是重中之重。
　　志賀菌攜帶的Ⅲ型分泌系統(tǒng)是對(duì)抗宿主免疫系統(tǒng)的重要武器，而毒力因子IcsA(VirG)是其在宿主細(xì)胞間有效擴(kuò)散所必需的。有研究表明，HtrA可以促進(jìn)VirG在細(xì)菌表面的準(zhǔn)確定位，扮演著毒力因子的角色。此外，志賀氏菌

2、的傳播方式為糞口途徑，在抵達(dá)其定植部位大腸之前，首先需要耐受胃酸等極端環(huán)境。目前在多種病原菌中已報(bào)道，HtrA對(duì)于細(xì)菌在高溫、偏酸或偏堿性等極端環(huán)境下的生長(zhǎng)具有重要作用。因此，對(duì)于HtrA蛋白酶功能的研究可以幫助發(fā)現(xiàn)更多的毒力相關(guān)蛋白，以便更好的了解志賀菌的具體致病機(jī)理，從而為疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。
　　HtrA蛋白在多數(shù)病原菌中序列保守，具有分子伴侶和蛋白酶活性雙重功能，存在于周間質(zhì)，是周間質(zhì)內(nèi)蛋白的重要質(zhì)量調(diào)控因子。目前

3、關(guān)于HtrA蛋白的報(bào)道，大多是針對(duì)它的分子伴侶和蛋白酶活性進(jìn)行研究。然而，在實(shí)驗(yàn)室前期關(guān)于ArgT蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，HtrA蛋白在雙向電泳膠圖上呈現(xiàn)分子量相同但等電點(diǎn)不同的兩個(gè)蛋白點(diǎn)，且兩個(gè)蛋白點(diǎn)之間會(huì)根據(jù)底物變化出現(xiàn)“此消彼長(zhǎng)”的現(xiàn)象。于是推測(cè)，HtrA可能存在著某種翻譯后修飾。目前，針對(duì)HtrA蛋白的研究中尚未有關(guān)于此現(xiàn)象的報(bào)道。
　　將從蛋白酶活性和翻譯后修飾兩方面對(duì)HtrA蛋白進(jìn)行具體研究。擬通過(guò)本研究，找出志賀菌中Htr

4、A的潛在底物蛋白，鑒定出更多毒力相關(guān)蛋白，為更好的了解志賀菌的致病機(jī)理提供依據(jù)。此外，通過(guò)已經(jīng)解析出的晶體結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析，在全新領(lǐng)域?qū)trA蛋白進(jìn)行研究，找出潛在的修飾位點(diǎn)并確定修飾形式。
　　在HtrA蛋白酶活性的研究中，首先構(gòu)建htrA的上調(diào)表達(dá)菌株和下調(diào)表達(dá)菌株。然后利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)比不同表達(dá)菌株的蛋白表達(dá)譜，分析潛在的底物蛋白。其中，上調(diào)表達(dá)利用外源導(dǎo)入阿拉伯糖操縱子實(shí)現(xiàn)可控誘導(dǎo);下調(diào)表達(dá)則選擇CRISPRi

5、技術(shù)進(jìn)行沉默。由于志賀菌的基因組存在大量可移動(dòng)元件，特別是毒力核心區(qū)的自發(fā)突變率很高，因此在成功構(gòu)建htrA上調(diào)和下調(diào)表達(dá)菌株后，需要對(duì)毒力基因進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以確保毒力核心區(qū)和基因組的完整性，以及后續(xù)研究的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。測(cè)序和毒力PCR驗(yàn)證完全正確的菌株，再使用自制的HtrA蛋白多克隆抗體，通過(guò)Western Blot檢測(cè)HtrA蛋白表達(dá)的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)上述上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)菌株均構(gòu)建成功。
　　菌株構(gòu)建成功后，選擇雙向電

6、泳技術(shù)對(duì)蛋白進(jìn)行分離，再通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析可能存在的底物蛋白，并利用MALDI-TOF/TOF進(jìn)行蛋白點(diǎn)的鑒定。由于HtrA蛋白存在于周間質(zhì)，因此要尋找其天然底物蛋白，最直接的方法是提取周間質(zhì)蛋白進(jìn)行分析。另外，HtrA蛋白也參與外膜蛋白的合成，需提取外膜蛋白進(jìn)行輔助驗(yàn)證。最后再通過(guò)全菌蛋白表達(dá)譜的對(duì)比，可進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　在周間質(zhì)蛋白提取物的表達(dá)譜分析中，選擇不同溫度（30℃發(fā)揮分子伴侶活性和37℃發(fā)揮蛋白酶活性）條

7、件下的htrA上調(diào)和下調(diào)表達(dá)菌株周間質(zhì)蛋白進(jìn)行對(duì)比研究。最終的質(zhì)譜結(jié)果分析得出:PhoN1、PhoN2和GlnH蛋白為潛在底物蛋白。其中PhoN1和PhoN2擁有50％的序列一致，均為周間質(zhì)中的一種非特異性酸性磷酸酶。兩者在37℃條件下提取的周間質(zhì)蛋白中，htrA上調(diào)表達(dá)時(shí)，均出現(xiàn)明顯的表達(dá)量偏低現(xiàn)象。然而在30℃時(shí)提取的周間質(zhì)蛋白中，發(fā)現(xiàn)不同菌株間PhoN1和PhoN2蛋白表達(dá)量均沒有明顯差異，說(shuō)明上述兩個(gè)蛋白的差異表達(dá)與HtrA的分

8、子伴侶活性無(wú)關(guān)。因此，推測(cè)PhoN2和PhoN1是HtrA的底物蛋白。此外，還發(fā)現(xiàn)在37℃條件下，周間質(zhì)谷氨酰胺結(jié)合蛋白GlnH的變化趨勢(shì)與HtrA蛋白的變化趨勢(shì)截然相反，而在30℃卻無(wú)明顯差異，因此懷疑GlnH蛋白也是HtrA蛋白的底物蛋白。
　　在37℃條件下外膜蛋白提取物的蛋白表達(dá)譜分析中，發(fā)現(xiàn)在HtrA蛋白的表達(dá)量降低時(shí)，外膜蛋白OmpA的表達(dá)量也隨之降低。這一現(xiàn)象也驗(yàn)證了HtrA蛋白參與OmpA的合成一說(shuō)。此外，在37℃

9、條件下全菌蛋白表達(dá)譜的分析中，發(fā)現(xiàn)PhoN2的變化趨勢(shì)同它在37℃時(shí)周間質(zhì)中的變化相似，進(jìn)一步證實(shí)了PhoN2是HtrA的底物蛋白。由于PhoN1的等點(diǎn)點(diǎn)為6.9，而全菌蛋白使用的是pH4-7和pH6-11的膠條進(jìn)行的雙向電泳，因此在最終的兩個(gè)pH梯度膠圖中都不能夠鑒定到PhoN1蛋白。
　　在關(guān)于HtrA的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體研究中，先選擇酶活位點(diǎn)突變株進(jìn)行雙向電泳，得到膠圖上的HtrA仍為兩個(gè)蛋白點(diǎn)，因此首先排除了酶活位點(diǎn)存在修飾的可能

10、性。接著，采用高精度液相質(zhì)譜先對(duì)雙向膠圖上的兩個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行分析。經(jīng)Typsin、GLu-C、Chymotrypsin三種酶分別對(duì)HtrA的兩個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行消化后得出:修飾位點(diǎn)可能落在57-63位氨基酸區(qū)間。該區(qū)段位于HtrA晶體結(jié)構(gòu)中的柔性Q-linker區(qū)域內(nèi)部，無(wú)明確的三維結(jié)構(gòu)定位，所以只能利用丙氨酸掃描逐個(gè)分析可能存在修飾的位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)57位C、58位Q、59位E、61位S四個(gè)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到301/C57A、301/Q58

11、A、301/E59A、301/S61A點(diǎn)突變株。雙向電泳結(jié)果顯示，這些突變株的雙向電泳圖譜中，HtrA均為兩個(gè)蛋白點(diǎn)。因此，可以基本排除C57、Q58、E59和S61位存在修飾的可能性。
　　綜上所述，本研究通過(guò)外源阿拉伯糖操縱子構(gòu)建htrA上調(diào)菌株，CRISPRi技術(shù)構(gòu)建下調(diào)表達(dá)菌株。之后，用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析37℃和30℃不同溫度條件下，不同菌株周間質(zhì)蛋白的表達(dá)差異情況，再輔以外膜差異表達(dá)蛋白和全菌差異表達(dá)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，最終得