川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠的抑瘤效果及其作用機(jī)制.pdf

1、據(jù)2016年世界肺癌聯(lián)盟數(shù)據(jù)顯示，全球每年約160萬人死于肺癌，肺癌已成為全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。我國也是世界上肺癌患者最多的國家，每年約73萬人被確診為肺癌。隨著我國工業(yè)化高速發(fā)展導(dǎo)致霧霾現(xiàn)象日益嚴(yán)重和吸煙率的不斷增加，肺癌的發(fā)病率在我國正迅速增加，已成為我國人口惡性腫瘤死亡原因的首要位置。隨著醫(yī)療技術(shù)水平不斷提高，其治療方法逐漸多樣化，目前肺癌治療的手段有化學(xué)治療、放射治療、外科手術(shù)、微創(chuàng)治療、免疫及中醫(yī)藥治療等，但無論

2、是采用哪種治療方法并發(fā)癥多、預(yù)后差，治療的總體療效并不樂觀，因此尋求新的治療方法迫在眉睫。惡性腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移均依賴于血管生成，因此抑制血管新生即可抑制腫瘤的發(fā)展。調(diào)控腫瘤血管生成的關(guān)鍵在于血管生成促進(jìn)因子和抑制因子，因此掌控二者的動態(tài)平衡成為治療腫瘤至關(guān)重要的一步。趨化因子CXCL16(chemokine CXCL16)是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的趨化因子，屬于CXC型趨化因子家族，具有多種生物學(xué)活性，能介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和血管生成。腫瘤壞

3、死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)是目前公認(rèn)的抗腫瘤作用最強(qiáng)的因子，既能與受體結(jié)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，又能作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管功能紊亂，進(jìn)而抑制腫瘤的生長。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是活血化瘀藥川芎中分離得到的有效成分，具有抗腫瘤血管新生的作用，進(jìn)而起到抗腫瘤作用，但機(jī)制有待進(jìn)一步研究。順鉑(cis-diamminedichloroplatin，DDP)是

4、第一個合成的鉑類抗癌藥物，結(jié)構(gòu)簡單，機(jī)理明確，是臨床上常用的化療藥物之一。近年來國內(nèi)許多學(xué)者研究表明，腫瘤化療藥物與血管新生抑制中藥聯(lián)合使用，能顯著增加化療藥物的抗腫瘤療效。本實驗研究通過Lewis肺腺癌移植瘤模型的建立，研究川芎嗪、順鉑對各模型組小鼠體重、腫瘤體積、腫瘤重量及血管因子CXCL16和TNF-α表達(dá)的影響。旨在闡明川芎嗪和順鉑聯(lián)合使用抗腫瘤血管生成的可能機(jī)制，探索有效的抗腫瘤藥物，為未來抗腫瘤用藥的新策略奠定實驗理論基礎(chǔ)。

5、具體實驗研究內(nèi)容如下。
　　建立小鼠移植瘤模型，培養(yǎng)Lewis小鼠肺腺癌細(xì)胞，選取對數(shù)期生長良好的細(xì)胞，將稀釋好的細(xì)胞注射到5～6周齡健康雄性C57BL/6小鼠右腋皮下，接種細(xì)胞后14天，測量小鼠皮下腫瘤約8mm左右，將64只成瘤小鼠隨機(jī)分組，共4組:生理鹽水組(NS，0.9％NaCl)，順鉑組（DDP,2mg·kg-1），川芎嗪組（TMP,100mg·kg-1），聯(lián)合組（TMP+DDP，劑量同上），每組16只。接種后第14天開始

6、按上述劑量腹腔注射給藥，連續(xù)給藥2周，每天觀察小鼠精神狀態(tài)，并測量皮下腫瘤長短徑并計算腫瘤體積。給藥結(jié)束24小時后引頸處死小鼠，將右腋皮下腫瘤剝離稱瘤重并計算抑瘤率，同時將剝離瘤組織用固定液固定。采用透射電鏡技術(shù)觀察小鼠腫瘤組織結(jié)構(gòu)、免疫組化SP法和酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測CXCL16和NF-α的表達(dá)情況。
　　用藥結(jié)束后，以生理鹽水組小鼠為對照，通過觀察小鼠的精神狀況、活動情況、飲食狀態(tài)、腫瘤大小及重量等指標(biāo)，評價小鼠生存情況及化

7、療藥物對小鼠毒副作用的影響。實驗結(jié)果為:以生理鹽水組為對照組，川芎嗪組小鼠一般生活情況較好，皮下腫瘤生長速度較快;順鉑組小鼠一般生活情況最差，精神不振、行動遲緩、毛色發(fā)黃、脫毛明顯等現(xiàn)象，皮下腫瘤生長速度慢。聯(lián)合用藥組小鼠一般生活情況較順鉑組好，比川芎嗪組差，皮下腫瘤生長速度最慢。各模型組皮下腫瘤體積從大到小依次為:生理鹽水組、川芎嗪組、順鉑組、聯(lián)合組。各模型組皮下瘤重關(guān)系為:生理鹽水組＞川芎嗪組＞順鉑組＞聯(lián)合組，抑瘤率分別為:川芎嗪組

8、(21.69％)、順鉑組(40.74％)、聯(lián)合組(61.11％)，聯(lián)合組抑瘤率最大，川芎嗪組抑瘤率較順鉑組差(P＜0.05)。結(jié)果說明川芎嗪、順鉑二者均有抑制腫瘤生長的作用，川芎嗪較順鉑抑瘤作用差，川芎嗪聯(lián)合順鉑抑瘤作用最強(qiáng)，二者存在協(xié)同增效作用。采用透射電鏡觀察各用藥組腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn):細(xì)胞膜缺損，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及脫顆粒，線粒體形狀異常，結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞核增大，核仁碎裂，染色質(zhì)趨邊。順鉑組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變程度明顯大于川芎嗪組，聯(lián)合組細(xì)胞改變最明

9、顯，細(xì)胞變圓，染色質(zhì)凝聚、分塊，胞質(zhì)皺縮，出現(xiàn)內(nèi)含胞質(zhì)、細(xì)胞器及核碎片的凋亡小體，被周圍細(xì)胞吞噬。免疫組織化學(xué)SP法檢測CXCL16和TNF-α的表達(dá)結(jié)果顯示:CXCL16在四組中均呈陽性表達(dá)，與生理鹽水組(41.27±7.61)×103比較，川芎嗪組(26.31±3.67)×103、順鉑組(25.46±3.46)×103以及聯(lián)合治療組(16.59±4.39)×103表達(dá)明顯減少，且聯(lián)合治療組表達(dá)最低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)

10、。TNF-α在四組中均呈陽性表達(dá)，與生理鹽水組(12.78±5.14)×103比較，川芎嗪組(15.42±3.18)×103、順鉑組(16.16±3.69)×103以及聯(lián)合治療組(22.57±4.51)×103表達(dá)明顯增加，且聯(lián)合治療組表達(dá)最高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。酶聯(lián)免疫吸附法檢測CXCL16和TNF-α的表達(dá)結(jié)果顯示:CXCL16在四組中均呈陽性表達(dá)，與生理鹽水組(117.74±7.61)比較，川芎嗪組(102.78

11、±6.12)、順鉑組(101.38±5.49)以及聯(lián)合治療組(80.94±5.78)表達(dá)明顯減少，且聯(lián)合治療組表達(dá)最低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。TNF-α在四組中均呈陽性表達(dá)，與生理鹽水組(54.69±7.45)比較，川芎嗪組(60.46±4.17)、順鉑組(61.39±1.02)以及聯(lián)合治療組(68.58±0.12)表達(dá)明顯減少，且聯(lián)合治療組表達(dá)最高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。采用免疫組化與酶聯(lián)免疫吸附法檢測CX