羊無漿體間接ELISA檢測方法的建立與應用.pdf

1、羊無漿體(Anaplasma ovis)是一種由媒介蜱傳播的專性紅細胞內寄生的革蘭氏陰性菌，主要引起綿羊和山羊的無漿體病。羊無漿體病臨床癥狀主要表現為發(fā)熱、貧血、黃疸和消瘦，嚴重時可導致死亡。羊無漿體病在全世界呈廣泛流行，阻礙了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了嚴重的經濟損失。目前，針對該病的檢測技術主要有血涂片顯微鏡鏡檢和PCR，但是相對于基層單位，顯微鏡鏡檢專業(yè)性太強，PCR儀器較為昂貴，且由于基層的科研條件有限，所以在實際生產中推廣應用

2、較困難。本研究以羊無漿體為研究對象，通過質譜和生物信息學分析技術，鑒定出羊無漿體特異性的Anaplasma ovis Appendage-Associated Protein(AAAP)，針對該蛋白，建立了檢測羊無漿體特異性抗體的間接ELISA檢測技術。應用本研究建立的方法，對采自我國23個省份54個不同地區(qū)的3138份血清進行羊無漿體病的血清學流行病學調查。
　　1.利用免疫沉淀技術分析找出羊無漿體感染實驗動物前后抗體變化的差異

3、蛋白條帶，通過質譜鑒定，與基因組數據比對，BLAST比對分析，篩選出相似度低于45％的特異性的羊無漿AAAP蛋白。
　　2.利用原核表達載體對羊無漿體AAAP基因進行截短表達，純化，經Western-blot分析表明重組蛋白與羊無漿體陽性血清具有較好的反應性，與綿羊肺炎支原體、山羊支原體山羊亞種、莫氏巴貝斯蟲臨潭株、巴貝斯蟲未定種新疆株、尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲的陽性血清無交叉反應，表明該蛋白適合用作羊無漿體病的診斷抗原。
　

4、　3.以重組的羊無漿體AAAP蛋白為抗原，建立了用于羊無漿體病抗體檢測的間接ELISA方法。通過對597份參考血清（434份陰性血清和163份陽性血清）檢測，經MedCalc軟件分析，當確定ELISA方法的閾值為6.00％時，其特異性為94.5％，敏感性為91.4％。
　　4.應用本研究建立的間接ELISA方法對我國23省份54個不同地區(qū)的3138份血清進行檢測，結果顯示羊無漿體病在我國23個省份均有流行，不同省份羊無漿體的抗體陽