TLE4促進結(jié)直腸癌細胞增殖和遷移的作用及分子機制研究.pdf

1、研究目的:
　　結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。據(jù)報道，全球結(jié)直腸癌每年新發(fā)病例數(shù)約120萬，發(fā)病率居所有惡性腫瘤中的第3位，病死率居第4位。此外，隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且發(fā)病年齡呈年輕化特點。轉(zhuǎn)移是引起CRC患者死亡的首要原因，大多數(shù)病人在確診時就已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移。因此，深入探討結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找早期診斷、早

2、期治療和預(yù)防的有效途徑，始終是結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。
　　TLE4基因是Groucho/Tle基因家族的重要成員之一，Groucho/Tle蛋白在胚胎發(fā)育和形態(tài)發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，可調(diào)控相關(guān)關(guān)鍵信號通路的活性，包括受體酪氨酸激酶/Ras/MAPK、Notch、Wnt、Hedgehog、JNK等信號通路。據(jù)報道，TLE4在造血功能、骨發(fā)育過程中起著重要作用，有研究提示TLE4在急性髓性白血病(acute myelogeno

3、us leukemia，AML)中起著抑制作用。在白血病細胞株中下調(diào)TLE4表達可以增加白血病細胞的分裂，過表達TLE4可引起細胞凋亡的增加。然而，關(guān)于TLE4在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的實體腫瘤中的作用知之甚少。我們前期的生物信息學(xué)分析顯示，TLE4在結(jié)直腸癌組織中表達水平顯著高于配對的癌旁正常腸粘膜組織;但是，TLE4在結(jié)直腸癌發(fā)生和演進過程中的作用及分子機制目前尚不清楚。
　　本課題擬檢測TLE4蛋白在結(jié)直腸癌中的表達情況，分析其表

4、達與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系，并通過多種體內(nèi)外實驗研究TLE4在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用及相關(guān)分子機制，以期為結(jié)直腸癌的個體化診療和靶向藥物的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.運用公共數(shù)據(jù)庫(GEO)數(shù)據(jù)分析TLE4在結(jié)直腸癌中的表達情況;
　　2.利用Western blot和實時定量PCR技術(shù)檢測TLE4在新鮮結(jié)直腸癌和配對癌旁正常組織標本中的表達情況;通過免疫組化技術(shù)檢

5、測結(jié)直腸癌患者石蠟組織標本中TLE4的表達，分析其與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征及預(yù)后間的相關(guān)性;
　　3.通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建TLE4穩(wěn)定過表達和干擾表達的結(jié)直腸癌細胞株，并通過實時定量PCR和Western blot技術(shù)檢測TLE4和相關(guān)信號通路蛋白在穩(wěn)定細胞株中mRNA和蛋白水平的表達情況;
　　4.通過平板克隆形成實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、MTT實驗體外檢測TLE4穩(wěn)定過表達和干擾對結(jié)直腸癌細胞增殖能力的影響，通過Tra

6、nswell實驗體外檢測TLE4穩(wěn)定過表達和干擾對結(jié)直腸癌細胞遷移能力的影響;利用裸鼠皮下成瘤模型，并運用免疫組化實驗體內(nèi)檢測TLE4穩(wěn)定過表達和干擾對結(jié)直腸癌細胞增殖能力的影響;
　　5.實時定量PCR和Western blot技術(shù)檢測TLE4穩(wěn)定過表達和干擾后結(jié)直腸癌細胞中JNK/c-Jun通路及其相應(yīng)靶點分子的變化;
　　6.使用JNK抑制劑SP600125處理SW480/TLE4和HT29/TLE4細胞24小時后，進

7、一步通過Western blot檢測JNK/c-Jun通路及其相應(yīng)靶點分子的變化，通過MTT實驗、平板克隆形成實驗、軟瓊脂克隆形成實驗和Transwell實驗檢測結(jié)直腸癌細胞的增殖及遷移能力。
　　研究結(jié)果:（數(shù)據(jù)使用SPSS20.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行分析）
　　1.TLE4在結(jié)直腸癌組織中表達水平較配對癌旁正常組織顯著升高;其表達水平與患者Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間呈正相關(guān)關(guān)系;

8、　　2.Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示，TLE4高表達組的總體生存率顯著低于低表達組，與患者的生存預(yù)后呈負相關(guān)關(guān)系;
　　3.TLE4的過表達促進結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和裸鼠皮下成瘤能力，而干擾TLE4表達后則抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和裸鼠皮下成瘤能力;
　　4.TLE4能激活JNK/c-Jun分子信號通路的活性，使用JNK/c-Jun分子信號通路阻滯劑SP600125能夠抵消TLE4促進結(jié)直腸癌細胞增殖和遷移