C末端調(diào)節(jié)蛋白在糖尿病腎臟細胞外基質(zhì)沉積中的作用.pdf

1、目的：糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy, DN）是糖尿病最主要的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生命。它的病理特征主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)的積聚，腎小管上皮細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)以及腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，并最終導(dǎo)致腎功能的進行性衰竭。膠原是細胞外基質(zhì)最主要的組成成分，大約有28種不同膠原類型被發(fā)現(xiàn)，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原是較為常見的。另

2、外，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1, TGF-β1）及α平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin,α-SMA）在多種器官和組織中均是公認的調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子。
　　PI3K/Akt是一種多功能信號通路，具有介導(dǎo)細胞增殖、分化、遷移、脂質(zhì)代謝及纖維化等的活性。PI3Ks通過磷酸化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）肌醇環(huán)的第3位碳原子，而

3、形成PIP3，進而激活A(yù)kt（又稱蛋白激酶B，protein kinase B, PKB）而發(fā)揮多種生物學(xué)功能。新近研究揭示PI3K/Akt信號通路與糖尿病腎病纖維化的發(fā)生相關(guān)。我們前期的研究也揭示PI3K/Akt信號通路能夠上調(diào)TGF-β1及固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding protein-1, SREBP-1）的表達，介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細胞脂滴合成和細胞外基質(zhì)的積聚。

4、因此，針對PI3K/Akt通路進行調(diào)控干預(yù)，成為防治糖尿病腎小球和腎小管病變的研究熱點。
　　研究揭示PI3K/Akt通路的負向調(diào)控因子有SH2結(jié)構(gòu)含磷酸肌醇（SH2 domain-containing inositol5’-phosphatase, SHIP）、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, PT

5、EN）和C末端調(diào)節(jié)蛋白（carboxyl-terminal modulator protein,CTMP）等。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)PTEN通過抑制Akt的活性能下調(diào)SREBP-1/FASN/ACC信號途徑及人腎小管上皮細胞的脂肪酸合成，同時還能抑制糖尿病小鼠腎臟結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor, CTGF）的表達及細胞外基質(zhì)的分泌。然而CTMP在糖尿病腎病細胞外基質(zhì)沉積的影響卻未見報道。

6、r>　　因此，本研究應(yīng)用糖尿病小鼠模型以及體外高糖刺激的人腎小管上皮細胞為研究對象，從動物及細胞水平上整體觀察糖尿病腎臟中CTMP蛋白表達情況，以及過表達的CTMP對磷酸化Akt（phospho-Akt(Ser473)）、TGF-β1、α-SMA等蛋白的表達及細胞外基質(zhì)沉積的影響。
　　方法：
　　1、 phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA、ColⅢ及FN在糖尿病小鼠腎臟的表達和意義

7、r>　　將CD1小鼠隨機分為兩組：分別為正常對照組（normal control group, N組）以及糖尿病組（diabetes mellitus group, DM組），每組各10只。糖尿病小鼠模型采用腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ,溶于0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值為4.5，150 mg/kg），對照組只注射相當(dāng)體積的枸櫞酸鹽緩沖液，48 h后尾尖取血測量血糖，血糖≥16.7 mmol/L

8、者確定造模成功，未達標(biāo)者舍棄。于造模成功8周后處死小鼠，于處死前1天將各組小鼠在代謝籠中單獨飼養(yǎng)收集24 h尿液，用于記錄尿量，測量24 h尿蛋白水平。禁食6-8 h，將小鼠稱重后異氟烷吸入麻醉，隨后摘眼球取血，并迅速離心分離血清，用于血肌酐、血糖和血尿素氮的測定；取部分腎皮質(zhì)組織經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于提取蛋白及RNA；另外部分腎組織置于4％多聚甲醛固定，用于石蠟包埋及制片。應(yīng)用Western blot、免疫組化以及 Re

9、al-time PCR觀察糖尿病小鼠腎臟phospho-Akt、CTMP、TGF-β1、α-SMA、Ⅲ型膠原（CollagenⅢ, ColⅢ）、纖維粘連蛋白（Fibronectin, FN）蛋白及CTMP mRNA的表達。
　　2、高糖對人腎小管上皮細胞phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA表達和ColⅠ、ColⅢ分泌的影響
　　人腎小管上皮細胞（HKC細胞）用含100 kU/L青霉素、1

10、00 mg/L鏈霉素以及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并隨機分為正常糖對照組（5.5 mmol/L glucose,Control）以及高糖組（30 mmol/L glucose, HG），并于高糖刺激后0、6、12、24以及48 h收集細胞，提取總蛋白，Western blot檢測phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA蛋白的表達；免疫細胞熒光檢測CTMP蛋白表達和定位；細胞上清液中Ⅰ型膠原（C

11、ollagenⅠ, ColⅠ）、ColⅢ分泌情況采用ELISA方法檢測。
　　3、 CTMP表達質(zhì)粒對高糖刺激人腎小管上皮細胞內(nèi)phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA表達和ColⅠ、ColⅢ分泌的影響
　　人腎小管上皮細胞采用DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)（其中含有10%胎牛血清及100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素），培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。應(yīng)用Lipofectamine2000

12、轉(zhuǎn)染試劑將pYr-ads-4-CTMP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HKC，經(jīng)G418篩選，建立HKC CTMP基因轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細胞系，將細胞隨機分為4組：正常糖對照組（5.5 mmol/L glucose,Control），高糖組（30 mmol/L glucose, HG），高糖及pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒對照組（HG+V），高糖及pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（HG+CTMP）。后三組給予高糖刺激48 h后終止培養(yǎng)，進行免疫熒光染色

13、和蛋白提取。采用Western blot檢測phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA蛋白表達，ELISA方法檢測ColⅠ、ColⅢ分泌情況。
　　4、 CTMP表達質(zhì)粒對糖尿病小鼠腎臟內(nèi)phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA、ColⅢ、FN表達及細胞外基質(zhì)沉積的影響
　　將CD1小鼠隨機分為四組：分別為正常對照組（Control組）、糖尿病組（DM組）、糖

14、尿病+空質(zhì)粒組（DM+V）和糖尿病+CTMP質(zhì)粒組（DM+CTMP），每組10只。質(zhì)粒注射組小鼠在成模4周后，分別給予尾靜脈快速注射pYr-ads-4-CTMP質(zhì)?；?pYr-adshuttle-4質(zhì)粒(1 mg/kg body weight)。此后每隔7天注射一次，共注射4次，之后處死小鼠并收集保存標(biāo)本進行相關(guān)檢測。
　　結(jié)果：
　　1、糖尿病小鼠腎臟 CTMP表達降低伴隨 phospho-Akt(Ser473)、TGF-

15、β1、α-SMA和細胞外基質(zhì)的表達增加
　　同正常對照組小鼠相比，糖尿病小鼠血糖、24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮水平分別是正常對照組的4.92、2.84、1.66及7.12倍。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，CTMP主要定位于正常對照組小鼠腎小管上皮細胞的胞漿，腎小球內(nèi)未見明確表達；而糖尿病小鼠腎臟CTMP表達較弱，Image-Pro Plus（IPP）軟件分析陽性區(qū)域積分光密度值（integrated optical density,

16、IOD）比正常對照組小鼠降低了63.33%。同樣地，通過Western blot技術(shù)進一步檢測了各組小鼠腎臟CTMP蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于正常對照組，糖尿病組小鼠腎臟內(nèi)CTMP的表達下降了37.7%。
　　免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1和α-SMA在糖尿病小鼠腎小管上皮細胞的胞漿中均有顯著表達，而正常對照組表達較弱。Western blot進一步檢測了蛋白的表達并進行半定量分析發(fā)現(xiàn)，糖

17、尿病小鼠腎臟phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1以及α-SMA的表達較正常對照組分別上調(diào)了3.66、1.29及2.33倍。
　　Masson染色結(jié)果顯示糖尿病小鼠腎小管間質(zhì)中可見灶性陽性信號分布，提示出現(xiàn)了細胞外基質(zhì)的沉積，而正常對照組未見明確陽性表達。另外，為了進一步驗證糖尿病小鼠腎臟細胞外基質(zhì)的沉積情況，我們采用免疫組化染色檢測了ColⅢ及FN的表達，結(jié)果提示糖尿病組小鼠腎臟內(nèi)出現(xiàn)顯著的陽性表達，主要定位于腎小

18、管上皮細胞的間質(zhì)內(nèi)，而正常對照組小鼠腎臟內(nèi)未見明顯表達。IPP軟件分析ColⅢ及FN陽性區(qū)域積分光密度值（IOD）分別是正常對照組的1.99及2.82倍。
　　2、高糖抑制人腎小管上皮細胞CTMP表達，并誘導(dǎo)phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1、α-SMA的上調(diào)及 ColⅠ、ColⅢ的分泌
　　Western blot檢測了0~48 h不同時間點高糖刺激對人腎小管上皮細胞CTMP、phospho-Akt(Se

19、r473)、TGF-β1及α-SMA表達的影響。結(jié)果顯示：CTMP蛋白在高糖刺激0 h時存在一定量的表達，且隨著刺激時間的延長而逐漸減少，并于高糖刺激后24 h達到最低點。免疫熒光染色顯示CTMP主要定位于人腎小管上皮細胞的胞漿，高糖刺激后CTMP表達明顯減弱。相反地，phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1及α-SMA蛋白的表達隨著高糖刺激時間的延長而逐漸升高，并于高糖刺激后24 h達到高峰，而總Akt的表達在各個時間點未

20、見顯著差異。
　　ELISA技術(shù)檢測了高糖刺激后0h及48 h兩個時間點細胞上清液中ColⅠ、ColⅢ的分泌情況。結(jié)果提示高糖刺激后48 h ColⅠ、ColⅢ的分泌較0h顯著增加。
　　3、 CTMP表達質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)下人腎小管上皮細胞CTMP的下調(diào)以及phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1和α-SMA的過表達
　　研究結(jié)果揭示pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功上調(diào)了人腎小管上皮細胞CTMP的表

21、達，經(jīng)Western blot定量分析顯示：與pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組相比，pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒使CTMP的表達上調(diào)了1.98倍。相反地， phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1及α-SMA的表達分別下調(diào)了35.11%、76.53%及51.59%，而總Akt的表達未見顯著差異。進一步，我們采用ELISA技術(shù)檢測了各組細胞上清液中ColⅠ和ColⅢ的分泌情況，結(jié)果顯示高糖刺激后48 h ColⅠ、C

22、olⅢ的分泌較0 h顯著增加（P<0.05），而經(jīng)pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，ColⅠ、ColⅢ的表達分別下調(diào)了32.31%及51.83%。
　　4、 CTMP表達質(zhì)粒上調(diào)糖尿病小鼠腎臟CTMP的表達并抑制Akt活化、TGF-β1、α-SMA的表達及細胞外基質(zhì)的沉積
　　與pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組相比，經(jīng)pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，糖尿病小鼠血肌酐、血尿素氮及24 h尿蛋白的水平均顯著降

23、低。RT-PCR結(jié)果分析顯示：糖尿病小鼠腎臟CTMP mRNA的表達較正常對照組顯著降低，而pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)了CTMP mRNA的表達。另外， Western blot結(jié)果進一步證實了pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠腎臟CTMP蛋白的表達明顯增加，較pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組上調(diào)了8.84倍；同時 phospho-Akt(Ser473)蛋白的表達受到顯著抑制，下降了60.00%(P<0.05

24、)。同樣地，免疫組化揭示了相似的結(jié)果，IPP軟件分析IOD值顯示：與pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組相比，pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠腎臟CTMP蛋白的表達上調(diào)了9.43倍，同時伴隨phospho-Akt(Ser473)的表達下降了54.33%。
　　進一步研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)尾靜脈注射pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒后，糖尿病小鼠腎臟TGF-β1及α-SMA蛋白的強陽性表達被顯著抑制。Western blot半定量分析

25、顯示，pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠腎臟TGF-β1、α-SMA的蛋白表達水平與 pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組相比分別下調(diào)了76.50%和24.37%。另外，Masson染色發(fā)現(xiàn)糖尿病組以及pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組小鼠腎臟腎小管間質(zhì)均出現(xiàn)了細胞外基質(zhì)的沉積，而 pYr-ads-4-CTMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組未觀察到明顯陽性信號。同時我們通過免疫組化進一步檢測了各組小鼠腎臟ColⅢ、FN的表達，發(fā)現(xiàn)pYr-ad

26、s-4-CTMP質(zhì)粒組小鼠腎小管上皮細胞間質(zhì)中ColⅢ、FN的表達較pYr-adshuttle-4空質(zhì)粒組分別降低了40.43%及51.47%。
　　結(jié)論：
　　1、糖尿病小鼠腎臟CTMP低表達同時伴隨phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1和α-SMA蛋白的表達增加及細胞外基質(zhì)的沉積。
　　2、高糖可誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞 CTMP低表達同時伴隨phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1和α-SM