聚乙二醇干擾素治療拉米夫定耐藥慢乙肝患者中耐藥毒株動態(tài)變化與療效的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　本研究采用的基于焦磷酸測序設(shè)計的試劑盒，其可檢測10個常見HBV耐藥突變相關(guān)位點(rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250)。所以，首先我們對焦磷酸測序試劑盒進行了性能及臨床適用性的評價，隨后通過焦磷酸測序定量檢測Peg-IFNα-2a治療過程中LAM耐藥患者耐藥毒株的動態(tài)變化，并研究耐藥毒株的演變與治療療效的關(guān)系。
　　方法：

2、　　一、標本來源
　　1.焦磷酸測序試劑盒臨床驗證標本及標準品
　　2.研究LAM耐藥毒株的演變及其與治療療效的關(guān)系的標本
　　二、實驗技術(shù)
　　1.核酸提取
　　使用QIAamp UltraSens Virus Kit從200μL血清樣本中提取40μL核酸樣品，提取步驟嚴格按照試劑盒的說明書進行，并在提取過程中采取必要措施防止樣本間的交叉污染。
　　2.焦磷酸測序
　　使用Qiagen公司提供

3、的焦磷酸測序試劑盒可檢測10個常見HBV耐藥突變相關(guān)位點:rt169、rt173、rtl80、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250。擴增使用Rotor-Gene Q實時熒光定量FCR分析儀，焦磷酸測序平臺為PyroMark(@) Q24 MDx（Qiagen，德國），測序步驟嚴格按照試劑盒的說明書進行。
　　三、測序數(shù)據(jù)分析
　　采用焦磷酸測序儀配套的分析軟件，首先進行單核苷酸多

4、態(tài)性(Singlenucleotide polymorphism，SNP)分析判定是否有突變。若該位點存在雜合突變，則進行突變株的比例分析，判斷突變病毒株在病毒準種中所占的比例，再通過后期線性關(guān)系計算出真實突變比例。
　　四、臨床指標檢測方法
　　1.血清HBV標志物的檢測
　　使用商業(yè)化的試劑盒，檢測方法為Abbott Architect I2000免疫化學(xué)發(fā)光法。
　　2.血清HBV DNA定量
　　P

5、CR熒光定量探針法，使用使用商業(yè)化的試劑盒Cobas Amplicor HBVMonitor V2.0檢測，檢測下限為60 IU/mL。
　　3.ALT
　　使用商業(yè)化的試劑盒，通過全自動生化檢測儀檢測，正常值上限為40U/L。
　　五、數(shù)據(jù)統(tǒng)計
　　本文中所有數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以平均值±標準差或中位數(shù)（范圍）表示，率的比較用卡方檢驗或Fisher確切概率檢驗分析。定量資料用兩獨

6、立樣本非參檢驗的Mann-Whitney U檢驗進行分析。陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、特異性、敏感性和ROC曲線下面積用來檢驗預(yù)測因子預(yù)測預(yù)后的相應(yīng)預(yù)測價值，線性關(guān)系評價采用線性擬合，所有結(jié)果均采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、焦磷酸測序試劑盒驗證
　　焦磷酸測序試劑盒的PCR工作下限為50 IU/mL;線性分析提示除rt236位點外，其他9個耐藥位點的突變比例真實值與檢測值線性關(guān)系均達

7、到R2＞0.98;臨床樣本檢測結(jié)果顯示，4例樣本部分位點PCR擴增失敗，98例樣本HBV DRT檢測結(jié)果與Sanger測序分析結(jié)果的總符合率達92.6％(897/969)，其中10個耐藥相關(guān)突變位點結(jié)果全部一致的樣本占46.9％(46/98);兩種測序方法在10個位點上的一致率介于71.5％至100％;兩種測序結(jié)果不一致中，87.5％(63/72)為Sanger測序結(jié)果為野生型(WT)而HBV DRT檢測結(jié)果為野生/突變混合型(WT/M

8、T)，6.9％(5/72)為Sanger測序結(jié)果為WT而HBV DRT檢測結(jié)果為MT，5.6％(4/72)為Sanger測序結(jié)果為WT/MT而HBV DRT檢測結(jié)果為WT。
　　二、LAM耐藥毒株的演變及其與治療療效的關(guān)系
　　1.焦磷酸測序結(jié)果
　　共123例Peg-IFNα-2a治療組患者納入分析，首先40例用于分析拉米夫定耐藥動態(tài)變化的患者在0周、24周、48周、72周的焦磷酸測序成功率為100％(40/40)、

9、82.5％(33/40)、70％(28/40)和87.5％(35/40)。隨后檢測了123例患者24周耐藥突變情況用于驗證其與療效關(guān)系，檢測成功率為91％（112/123）。
　　2.患者基線臨床特征。
　　共123例Peg-IFNα-2a治療組患者納入分析，其中101例為男性，22例為女性，中位年齡為33歲（19～63歲），血清HBV DNA水平為7.15±1.2 log IU/mL，AUT水平為72 U/L(9～1776

10、 U/L)。其中34例為基因B型，89例為基因C型。
　　3.基線耐藥突變
　　40例患者中M204V/I、L180M、A181V和V173L各位點上發(fā)生突變的人數(shù)占總?cè)藬?shù)百分比分別為100％(40/40)、82.5％(33/40)、60％(24/40)和10％(4/40)，該四位點在患者體內(nèi)突變比率中位數(shù)分別為95.8％(29.6％～100％)、80.5％(0％～97.1％)、5.9％(0％～16.8％)和0％(0％～97

11、％)。
　　4.Peg-IFNα-2a治療下耐藥毒株變化情況
　　rtM204V/I總突變百分率在完全應(yīng)答組(CR)的0周、24周、48周和72周分別為91.3±19.4％、19.9±27.1％、9.1±26.4％和15.8±27.4％;無應(yīng)答組(NR)的0周、24周、48周和72周分別為90±11.3％、47.2±32.2％、31.2±29.4％和21.3±29.9％。
　　rtL180M突變百分率在CR組的0周、2

12、4周、48周和72周分別為50±44.6％、11.2±27.1％、13.6±23.9％和13.4±25.5％; NR組的0周、24周、48周和72周分別為69.4±32.4％、31.2±29.6％、11.66±29.7％和9.2±18.9.％。
　　rtA181V突變百分率在CR組的0周、24周、48周和72周分別為5.8±5.9％、1.3±1.3％、1.0±2.1％和2.3±2.2％; NR組的0周、24周、48周和72周分別為

13、6.0±5.2％、4.6±2.8％、4.5±3.7％和5.3±3.2％。
　　5.基線耐藥毒株突變百分率與治療療效關(guān)系
　　基線rtM204V/I平均突變比率在CR組和NR組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(91.3±19.4％ vs90±11.3％，P=0.132)。
　　基線rtL180M平均突變比率在CR組和NR組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（50±44.6％vs69.4±32.4％P=0.307）。
　　基線rtA181V平均突變比

14、率在CR組和NR組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（5.8±5.9％ vs4.6±2.8％P=0.311）。
　　6.24周耐藥毒株突變比率與Peg-IFN治療應(yīng)答的關(guān)系
　　24周M204V/I、L180M和A181V等位點在CR組和NR組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異（P均＜0.01）。
　　40例患者24周時HBV DNA、HBsAg、M204V/I、L180M和A181V對于治療應(yīng)答的預(yù)測的ROC曲線下面積分別為0.866、0.872、0

15、.771、0.781和0.862。
　　全部123例患者的24周時HBV DNA、HBsAg、M204V/I、L180M和A181V對于治療應(yīng)答的預(yù)測的ROC曲線下面積分別為0.809、0.833、0.672、0.759和0.764。
　　7.24周預(yù)測完全應(yīng)答的最佳cut-off值
　　HBV DNA、HBsAg、M204V/I、L180M和A181V在24周預(yù)測完全應(yīng)答的最佳cut-off值分別為6 log IU/

16、mL、2 log IU/mL、20％、5％和5％。
　　結(jié)論：
　　1.焦磷酸試劑盒用于檢測乙肝耐藥基因具有良好的敏感性和準確性，在檢測樣本中存在少量病毒突變株時優(yōu)于直接測序，可用于耐藥突變的早期檢測。
　　2.基于本研究數(shù)據(jù)，我們并未發(fā)現(xiàn)基線病毒耐藥毒株突變百分率與治療療效的關(guān)系，基線時完全應(yīng)答組和無應(yīng)答組在M204V/I、L180M、A181V等三位點的耐藥毒株突變百分率無統(tǒng)計學(xué)差異，基線病毒耐藥毒株突變百分率并不

17、能預(yù)測治療應(yīng)答。
　　3.24周耐藥毒株突變比率水平的高低可預(yù)測Peg-IFN治療拉米夫定耐藥患者的療效，在全部123例患者M204V/I、L180M和A181V對于治療應(yīng)答的預(yù)測的ROC曲線下面積分別為0.672、0.759和0.764。但預(yù)測作用最強的仍是HBVDNA和HBsAg水平。
　　4.24周時，耐藥毒株突變比率水平結(jié)合HBV DNA和HBsAg水平可增強預(yù)測效能，當(dāng)HBV DNA＜6 log10 IU/mL，H