CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在自身免疫性肝炎中的作用研究.pdf

1、目的：
　　CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cell, Treg）是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，在保持對(duì)自身抗原和外來抗原耐受方面具有極其重要的作用。許多研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞數(shù)量及功能的缺陷參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究旨在利用人Ⅱ型自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis，AIH）的主要自身抗原——細(xì)胞色素P4502D6（Cytochrome P4502D

2、6，CYP2D6)免疫C57BL/6小鼠，建立Ⅱ型AIH小鼠模型（CYP2D6小鼠模型），同時(shí)收集AIH患者外周血標(biāo)本，觀察Treg細(xì)胞數(shù)量的變化及其功能性分子的表達(dá)情況，探討Treg細(xì)胞在AIH疾病進(jìn)展中的作用。
　　方法：
　　前期研究已成功構(gòu)建攜帶人CYP2D6目的基因的非復(fù)制型腺病毒（Ad-2D6）及不含CYP2D6的空白對(duì)照（Ad-GFP）。將Ad-2D6通過腹腔及靜脈途徑同時(shí)免疫C57BL/6小鼠，建立CYP2D

3、6小鼠模型，平行設(shè)立 Ad-GFP免疫對(duì)照組。如下方法評(píng)估模型的建立情況：
　?。?）免疫小鼠后1W、2W、3W、4W、6W、8W分別取肝組織行HE染色動(dòng)態(tài)觀察肝臟病理學(xué)改變；免疫小鼠后1W，取肝組織免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)CYP2D6抗原的表達(dá)情況；免疫小鼠后1W、2W、3W、4W、6W、8W分別收集血清，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IgG的滴度；間接免疫熒光法檢測(cè)血清中特異性自身抗體——抗CYP2D6抗體的表達(dá)。
　?。?

4、）流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)模型組及對(duì)照組小鼠脾臟、肝臟及外周血 Treg細(xì)胞的頻數(shù)及絕對(duì)計(jì)數(shù)；提取肝組織RNA，Real time qPCR技術(shù)檢測(cè)影響Treg細(xì)胞分化及功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白FOXP3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；評(píng)價(jià)肝內(nèi)Treg細(xì)胞抑制性功能分子CD39、TIGIT的表達(dá)情況
　　（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AIH患者外周血Treg細(xì)胞的頻數(shù)變化及其抑制性功能分子CD39、TIGIT的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　?。?）

5、成功建立CYP2D6小鼠模型。與對(duì)照組小鼠相比，模型小鼠肝細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)CYP2D6抗原；肝組織呈現(xiàn)界面性肝炎樣炎性損傷，即匯管區(qū)、中央靜脈周圍可見不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥始于匯管區(qū)并侵入肝實(shí)質(zhì)，引起周圍肝細(xì)胞壞死；模型小鼠血清總IgG滴度明顯升高、血清特異性自身抗體陽性表達(dá)，成功模擬了人Ⅱ型AIH的主要臨床特點(diǎn)。
　?。?）免疫后1W至第8W，與對(duì)照組相比，CYP2D6模型組小鼠肝臟內(nèi)Treg細(xì)胞的比例及絕對(duì)計(jì)數(shù)均明顯減少（

6、P<0.05）。外周血及脾臟中Treg的頻數(shù)在兩組間無差別。
　　（3）免疫后1W、4W及6W，與對(duì)照組相比，CYP2D6模型組小鼠肝臟FOXP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。
　?。?）免疫后1W及2W，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟TIGIT+Treg細(xì)胞的比例明顯升高（P<0.05），Treg細(xì)胞表達(dá)TIGIT的平均熒光強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)（P<0.05）。至免疫后6W，模型組小鼠肝臟TIGIT+Treg細(xì)胞

7、的比例顯著低于免疫后1W水平（P<0.05）。
　?。?）AIH患者外周血Treg的頻數(shù)與健康對(duì)照組相比無差別，但是其TIGIT+Treg細(xì)胞的比例明顯低于對(duì)照組（P<0.001）。
　　（6）結(jié)合AIH患者的疾病進(jìn)展行分層分析，發(fā)現(xiàn)進(jìn)展為肝衰竭的AIH患者的Treg頻數(shù)顯著低于未進(jìn)展為肝衰竭患者的水平（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　（1）成功建立Ⅱ型AIH小鼠模型——CYP2D6小鼠模型，為進(jìn)一步研究AIH

8、的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制提供了有力的工具。
　?。?）肝臟內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量的顯著減少可能是CYP2D6小鼠模型發(fā)生AIH的原因之一。
　?。?）針對(duì)肝臟Treg細(xì)胞數(shù)量的減少，CYP2D6模型小鼠在病程早期可通過促進(jìn)Treg細(xì)胞代償性高表達(dá)TIGIT活化分子以彌補(bǔ)其負(fù)性調(diào)控功能的不足，但隨著疾病進(jìn)展，最終代償機(jī)制失敗，導(dǎo)致了AIH的發(fā)生。
　?。?）進(jìn)展為肝衰竭的AIH患者其外周Treg細(xì)胞頻數(shù)顯著下降，提示Treg細(xì)胞的下