果蠅抗菌肽基因Andropin在大腸桿菌中的克隆與融合表達(dá).pdf

1、　　基于抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及前人所做的融合基因工作，本研究設(shè)計(jì)、合成了大小為34個(gè)氨基酸的果蠅抗菌肽基因(Andropin)片段，克隆到T-easyvector保存。隨后選擇E.coli高效融合表達(dá)載體pET32a連接目的片段，并轉(zhuǎn)染到大腸桿菌OrigammiB中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)的融合蛋白經(jīng)HIs-Tag親和層析純化和EK酶切后，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行活性檢測(cè)。1.實(shí)驗(yàn)中采用化學(xué)合成法合成了含有互補(bǔ)區(qū)的兩個(gè)目的片段和兩個(gè)引物，結(jié)合重疊區(qū)互補(bǔ)PC

2、R法擴(kuò)增得到完整的Andropin基因片段，將其克隆到T-easyvector上，測(cè)序正確。基因設(shè)計(jì)時(shí)除了加入合適限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，在目的片段前加入了腸激酶切位點(diǎn)。這將便于載體選用和后續(xù)酶切純化。2.實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了融合表達(dá)載體PET32a-Anp，PCR初步檢測(cè)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步測(cè)序正確。選用OrigammiB宿主菌進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并從溫度、誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)置不同條件，摸索最佳組合，提高表達(dá)量。降低培養(yǎng)溫度、延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間提高表達(dá)產(chǎn)物的可溶性。試驗(yàn)結(jié)

3、果表明轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的最佳培養(yǎng)溫度37℃，搖床培養(yǎng)3h后加入誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)溫度25℃，1mMIPTG誘導(dǎo)條件下，6h即可達(dá)到表達(dá)高峰，融合蛋白的表達(dá)量可占總蛋白的20-30﹪，表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為28KD。3.對(duì)基因工程重組菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波處理參數(shù)：超聲處理30s，間歇30s，工作12個(gè)循環(huán)。12000rpm，30min低溫高速離心，取上清用His-Tagpurify-cationkit親和層析純化，將純化的融合蛋白緩沖液進(jìn)行透