玉米赤霉烯酮降解酶高效分泌表達(dá)及其酶學(xué)特性研究.pdf

1、玉米赤霉烯酮是一類主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的具有致癌作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物，它能污染許多經(jīng)濟(jì)作物并引起全世界的食品和飼料安全問題，從而帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如何安全有效的對(duì)污染的糧食或飼料進(jìn)行脫毒處理，一直是一個(gè)比較棘手的問題。傳統(tǒng)物理脫毒和化學(xué)的脫毒方法操作性較差，容易破壞糧食的營(yíng)養(yǎng)成分，也容易引入二次污染。生物降解去除毒素具有反應(yīng)條件溫和、無有害試劑殘留的優(yōu)點(diǎn)，受到人們的青睞。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，以zlhy-6為目標(biāo)基因，對(duì)pAO815

2、和外源基因進(jìn)行改造和構(gòu)建，以得到高效分泌玉米赤霉烯酮降解酶的工程菌，并對(duì)降解酶的性質(zhì)進(jìn)行了研究，得出如下結(jié)論:
　　1.ZEN降解酶基因zlhy-6根據(jù)畢赤酵母基因密碼子偏好性優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化的序列前端引入α信號(hào)肽編碼序列后，送公司利用化學(xué)方法合成。通過反復(fù)酶切酶連的方法，利用畢赤酵母表達(dá)載體pAO815構(gòu)建含不同拷貝zlhy-6的重組表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10，經(jīng)抗性篩選，對(duì)陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

3、經(jīng)過酶切鑒定，得到了重組表達(dá)載體pAO815-α-zlhy-6、pAO815-（α-zlhy-6）2、pAO815-(α-zlhy-6)4、pAO815-(α-zlhy-6)6，分別含1、2、4、6個(gè)zlhy-6拷貝。
　　2.得到的一系列重組載體線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，經(jīng)組氨酸缺陷型平板、SDS-PAGE篩選陽性轉(zhuǎn)化子。并且通過SDS-PAGE比較不同轉(zhuǎn)化子的蛋白表達(dá)情況，對(duì)轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液酶活進(jìn)行比較，以得出ZEN降解

4、酶分泌量最高、酶活力最高的轉(zhuǎn)化子。不同拷貝轉(zhuǎn)化子中以pAO815-（α-zlhy-6）4轉(zhuǎn)化子蛋白分泌量最高，相應(yīng)具有較高的降解ZEN能力，發(fā)酵液中酶活力達(dá)10 U/mL。
　　3.用pAO815-(α-zlhy-6)4轉(zhuǎn)化子上清液進(jìn)行酶活性試驗(yàn)，反應(yīng)1h，重組酶對(duì)水溶液中20μg/mL ZEN的降解率可達(dá)到99％以上。
　　4.進(jìn)一步研究了溫度、pH、金屬離子等對(duì)酶活性的影響。明確了該酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，最適反應(yīng)pH