檉柳抗逆分子機理研究與相關(guān)基因的克隆.pdf

1、檉柳是抗逆能力強的植物，可以在干旱和鹽漬化土壤上良好生長。以檉柳為主要研究材料，應(yīng)用差異顯示、消減雜交、EST分析、基因芯片等技術(shù)研究其抗逆分子機理，并對部分抗逆基因進(jìn)行克隆。 建立了兩種木本植物總RNA的提取方法。兩種方法均以硼砂為緩沖液，分別用SDS、和CTAB為主要提取試劑，可以提取出高質(zhì)量的木本植物總RNA；SDS方法同時可以用于真菌、昆蟲等的RNA提取。對LiCl沉淀方法進(jìn)行了重要改進(jìn)，改進(jìn)的方法可在10min內(nèi)完全沉

2、淀RNA。 用差異顯示技術(shù)研究了NaHCO3脅迫下檉柳的基因表達(dá)情況，經(jīng)Northern檢測共獲得了17個基因片段，BlastX分析表明，有2個基因與F-box類蛋白家族成員同源性較高。1個基因與翻譯起始因子eIF成員有高的同源性。還獲得了分別與分泌型過氧化物酶和過氧化物酶基因同源性高的基因片段，過氧化物酶為植物對抗逆境脅迫的常見基因。另外，有5個與鹽堿脅迫密切相關(guān)的新序列，它們在脅迫前后差異表達(dá)明顯。這17個序列的GenBan

3、k接受號為CD028574-CD028581和CD028583-CD028591。 應(yīng)用消減雜交技術(shù)研究了NaHCO3脅迫下檉柳的基因表達(dá)情況，以NaHCO3脅迫檉柳cDNA為試驗方(tester)，正常生長檉柳cDNA為驅(qū)動方(Driver)。經(jīng)Northern雜交檢測，共獲得36個鹽脅迫應(yīng)答基因。BlastX分析表明，它們與下列基因同源：CAT和PRDX2個抗氧化酶基因；編碼海藻糖磷酸酯酶的基因；多種調(diào)控基因，包括bZIP轉(zhuǎn)

4、錄因子、MADS-box蛋白，富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白(Glycine-richRNA-bindingproteins)、CCCH型鋅指蛋白、F-box蛋白等的調(diào)控基因；早期光誘導(dǎo)蛋白，該基因可以修復(fù)由脅迫引起的植物光合系統(tǒng)損傷；半胱氨酸蛋白酶和VPE酶(vacuolarprocessingenzyme)，它們起降解受損細(xì)胞作用；以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白前體、聚合泛素、查爾酮合酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、NADP-IDH、OEE1等；同時，發(fā)現(xiàn)了6個鹽

5、脅迫應(yīng)答的新基因。 用差異顯示技術(shù)研究了NaHCO3脅迫下星星草的基因表達(dá)情況，經(jīng)反向Northern檢測，獲得了7個差異表達(dá)基因片段。其中，6個為脅迫后誘導(dǎo)表達(dá)的基因，1個為脅迫后抑制表達(dá)的基因。序列同源性分析表明，誘導(dǎo)表達(dá)的6個基因中，1個與鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)同源性較高，其余5個為新序列，脅迫后抑制表達(dá)的基因與假定adaptor蛋白同源性較高。結(jié)果提示，在NaHCO3脅迫后，星星草可能通過CDPK正向調(diào)控其抗鹽能力

6、，并調(diào)控脅迫信號的轉(zhuǎn)換。獲得的7個基因片段已經(jīng)在GenBank登錄，登錄號為CF198398-CF198404。 構(gòu)建了檉柳的cDNA文庫。以NaHCO3脅迫的檉柳為材料建立了cDNA文庫，文庫的初始滴度為5.7×105pfu，重組率為96％，插入片段平均長度約1.2kb，擴增后文庫的滴度為3.9×109pfu/mL。 對檉柳進(jìn)行了EST分析，共獲得2455條ESTs序列，它們代表了1936條無重復(fù)的單一序列(uniqu

7、esequence)。共有1452條ESTs與已知基因序列同源，其中：1452條ESTs與Nr數(shù)據(jù)庫蛋白同源，其余1386條為新序列。對EST進(jìn)行了GO(GeneOntology)分類，將這些ESTs分成了分子功能、生物學(xué)途徑和細(xì)胞組件三部分，同時進(jìn)行了pathway分析，共發(fā)現(xiàn)了125個生物學(xué)途徑。已知ESTs按功能分為12類，其中代謝占18.53％、防御占18.80％、蛋白質(zhì)合成占6.75％、能量占4.61％、轉(zhuǎn)運占6.75％、蛋白

8、質(zhì)定向占7.09％、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)占5.17％、細(xì)胞生長、分裂占4.61％、轉(zhuǎn)錄占6.75％、光合占8.82％、細(xì)胞結(jié)構(gòu)占1.79％、功能未知占10.33％。共發(fā)現(xiàn)了近400個與抗逆相關(guān)的EST序列，分析顯示檉柳抗逆是個多途徑作用的復(fù)雜體系，涉及脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因的表達(dá)調(diào)控、活性氧清除、水分和離子的轉(zhuǎn)運、滲透調(diào)節(jié)、脫水保護等多種途徑。 用基因芯片技術(shù)研究NaHCO3及干旱脅迫下檉柳基因的表達(dá)。將Cy5-dCTP分別標(biāo)記在干旱和NaHC

9、O3處理檉柳的cDNA上，Cy3-dCTP標(biāo)記在對照檉柳cDNA上。通過探針與芯片雜交，通過對兩種雜交信號強度比值的分析研究基因的差異表達(dá)，獲得了檉柳的干旱脅迫的基因表達(dá)譜和NaHCO3脅迫的基因表達(dá)譜。 其中，NaHCO3脅迫共獲得了89個差異表達(dá)的基因。其中，27個下調(diào)表達(dá)和62個上調(diào)表達(dá)的基因。BlastX分析表明這些基因按功能可以分為光合作用、活性氧清除、滲透調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)與表達(dá)調(diào)控、代謝、發(fā)育相關(guān)、核糖體蛋白、蛋白質(zhì)的

10、分解與再生、轉(zhuǎn)運類蛋白等幾大類別。同時，發(fā)現(xiàn)了一些與鹽脅迫相關(guān)的功能未知基因和新基因。揭示了檉柳的抗鹽脅迫涉及的幾種重要途徑。 干旱脅迫共獲得了114條基因。其中，49個下調(diào)表達(dá)和65個上調(diào)表達(dá)的基因。Blast分析表明這些基因按功能可以分為脫水保護、信號傳導(dǎo)與調(diào)控、活性氧清除、光合作用、代謝、核糖體蛋白、蛋白質(zhì)的分解與再生、轉(zhuǎn)運類蛋白等幾大類別。同時，發(fā)現(xiàn)了一些與干旱脅迫相關(guān)的功未知基因和新基因。研究揭示了檉柳抗旱的幾種重要途

11、徑。 比較了干旱與NaHCO3脅迫下檉柳基因芯片結(jié)果顯示，兩種脅迫中，有14條基因共同下調(diào)表達(dá)，31條共同基因上調(diào)表達(dá)，說明檉柳的抗旱、耐鹽性狀相似性較高。有1個基因干旱脅迫上調(diào)表達(dá)，NaHCO3脅迫下調(diào)表達(dá)。同時，和Lea蛋白、脫水誘導(dǎo)蛋白RD22同源的基因在干旱脅迫下表達(dá)量升高明顯，但NaHCO3脅迫表達(dá)量上升不明顯；NaHCO3脅迫使與SMDC基因和水通道蛋白同源的基因表達(dá)量明顯上升，而干旱脅迫其表達(dá)量無明顯升高，提示了檉