烏頭類生物堿調(diào)控外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:
　　烏頭類中藥臨床應(yīng)用廣泛，具有抗炎，免疫抑制，強(qiáng)心，止痛，抗腫瘤和降血壓等功效，臨床上常用來治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，跌打損傷，高血壓和腫瘤等各種疾病。但因具有強(qiáng)烈毒性，烏頭類中藥的臨床應(yīng)用也受到限制。烏頭類生物堿是烏頭類中藥的主要活性成分，同時(shí)也是其毒性成分。外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(efflux transporters，ETs)，主要包括P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，乳腺癌耐藥蛋白(Breast Cancer

2、Resistance Protein，BCRP)和多藥耐藥蛋白2（Mutidrug Resistance Protein2，MRP2），可將藥物或其它化學(xué)物質(zhì)排出細(xì)胞外，使機(jī)體免受或減少外來物的侵?jǐn)_。研究報(bào)道核受體(Nuclearreceptors，NRs)和核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor，Nrf2)信號(hào)通路是人體ETs表達(dá)的重要調(diào)控因子。
　　我們前期研究表

3、明，ETs可外排烏頭類生物堿。然而，烏頭類生物堿對(duì)ETs的影響尚未知曉，其表達(dá)和活性是否和烏頭類生物堿的毒性相關(guān)也未見報(bào)道。因此，本研究根據(jù)毒性高低選取了三種典型的烏頭類生物堿:烏頭堿(aconitine，AC)，苯甲酰烏頭原堿(benzoyiaconine，BAC)和烏頭原堿(aconine)，考察其對(duì)P-gp，MRP2和BCRP的調(diào)控及其機(jī)制。通過本研究結(jié)果，可了解服用烏頭類中藥后，體內(nèi)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化規(guī)律，預(yù)測(cè)烏頭類中藥與外排轉(zhuǎn)

4、運(yùn)蛋白底物藥物聯(lián)合使用時(shí)，發(fā)生藥物相互作用的可能性，為臨床上烏頭類中藥聯(lián)合用藥的安全性提供理論指導(dǎo)。
　　方法:
　　采用人源LS174T和Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞模型，人源HepG2肝癌細(xì)胞模型，穩(wěn)定表達(dá)啟動(dòng)子抗氧化應(yīng)答元件（antioxidant response element，ARE）-熒光素酶的HepG2-C8細(xì)胞模型和FVB小鼠模型。
　　分別采用Western-blot和real-time PCR考察AC/

5、BAC/aconine對(duì)P-gp/MRP2/BCRP，以及信號(hào)通路蛋白孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR），組成型雄甾烷受體(constitutive androstane receptor，CAR)和Nrf2表達(dá)水平的影響;采用共聚焦顯微鏡觀察P-gp/MRP2/BCRP在細(xì)胞膜上的定位和表達(dá);采用熒光探針底物結(jié)合流式細(xì)胞儀考察AC/BAC/aconine對(duì)P-gp/MRP2/BCRP外排功能的影響;采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)

6、染細(xì)胞系，考察AC/BAC/aconine對(duì)ARE-熒光素酶報(bào)告基因的影響等。
　　結(jié)果:
　　1 烏頭類生物堿調(diào)控P-gp的作用及機(jī)制
　　1.1 AC，BAC和aconine對(duì)LS174T和Caco-2細(xì)胞活性無顯著影響。
　　1.2 在LS174T和Caco-2細(xì)胞中，烏頭類生物堿顯著上調(diào)P-gp的蛋白和基因表達(dá)，且AC的上調(diào)作用強(qiáng)于BAC和aconine。AC也顯著上調(diào)FVB小鼠體內(nèi)空腸、回腸和結(jié)腸段的P

7、-gp蛋白表達(dá)。
　　1.3 在細(xì)胞中，烏頭類生物堿尤其是AC顯著增強(qiáng)細(xì)胞膜上P-gp的熒光強(qiáng)度，表明烏頭類生物堿可促進(jìn)P-gp蛋白轉(zhuǎn)移并富集于細(xì)胞膜上。
　　1.4 在細(xì)胞中，核受體抑制劑酮康唑顯著逆轉(zhuǎn)烏頭類生物堿對(duì)P-gp的誘導(dǎo)作用;同時(shí)，PXR和CAR也被烏頭類生物堿顯著上調(diào)，且表達(dá)趨勢(shì)和p-gp一致，Pearson相關(guān)分析顯示PXR和CAR蛋白表達(dá)與P-gp基因表達(dá)顯著相關(guān)。結(jié)果表明，核受體介導(dǎo)烏頭類生物堿對(duì)P-gp

8、的誘導(dǎo)作用，PXR和CAR受體是最有可能參與其過程的兩個(gè)核受體。
　　1.5 在細(xì)胞中，烏頭類生物堿顯著減弱細(xì)胞內(nèi)羅丹明123（rhodamine123，Rh123）的熒光強(qiáng)度，P-gp活性抑制劑維拉帕米可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)的Rh123平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，P-gp介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Rh123的外排;烏頭類生物堿可顯著增強(qiáng)P-gp的外排功能，且AC的作用強(qiáng)度大于BAC和aconine。
　　1.6 在細(xì)胞中，烏頭類生物堿顯著增加細(xì)胞

9、內(nèi)ATP水平，且AC的增加強(qiáng)度大于BAC和aconine，趨勢(shì)和P-gp功能變化趨勢(shì)一致;同時(shí)，烏頭類生物堿顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)線粒體質(zhì)量，增加趨勢(shì)和ATP水平變化趨勢(shì)一致。表明烏頭類生物堿可通過增強(qiáng)線粒體質(zhì)量上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP水平，從而增強(qiáng)P-gp的外排功能。
　　1.7 烏頭類生物堿尤其是AC預(yù)先培養(yǎng)LS174T和Caco-2細(xì)胞后，可顯著減弱P-gp底物抗癌藥物（長春新堿和阿霉素）對(duì)細(xì)胞的毒性作用。
　　1.8 小劑量AC預(yù)先

10、給藥FVB小鼠后，可降低FVB小鼠對(duì)單次大劑量AC給藥的急性毒性反應(yīng)，且24 h后小鼠死亡率顯著降低。
　　2 烏頭類生物堿調(diào)控MRP2和BCRP的作用及機(jī)制
　　2.1 AC，BAC和aconine對(duì)HepG2細(xì)胞活性無顯著影響。
　　2.2 在LS174T，Caco-2和HepG2細(xì)胞中，烏頭類生物堿顯著上調(diào)MRP2和BCRP的蛋白和基因表達(dá)，且AC上調(diào)作用弱于BAC和aconine; AC，BAC和aconine

11、顯著上調(diào)FVB小鼠空腸、回腸和結(jié)腸段中MRP2和BCRP的蛋白表達(dá)，且AC的上調(diào)作用弱于BAC和aconine。
　　2.3 在細(xì)胞中，烏頭類生物堿尤其是aconine可顯著增強(qiáng)細(xì)胞膜上MRP2和BCRP的熒光強(qiáng)度，表明烏頭類生物堿可促進(jìn)MRP2和BCRP蛋白轉(zhuǎn)移并富集于細(xì)胞膜上。
　　3.3 烏頭類生物堿可顯著上調(diào)細(xì)胞總蛋白和核蛋白中Nrf2的蛋白表達(dá)，且上調(diào)程度AC＜BAC＜aconine，表明烏頭類生物堿可促進(jìn)Nrf2

12、蛋白由細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核中，且aconine的作用最強(qiáng)。同時(shí)，在HepG2-C8細(xì)胞中，烏頭類生物堿可濃度和時(shí)間依賴性激活A(yù)RE熒光素酶活性，且上調(diào)程度AC＜BAC＜aconine，表明烏頭類生物堿可增強(qiáng)Nrf2與ARE結(jié)合而激活Nrf2通路，從而上調(diào)MRP2和BCRP的表達(dá)。
　　3.4 在Caco-2，LS174T和HepG2細(xì)胞中，烏頭類生物堿可顯著減弱胞內(nèi)CDF平均熒光強(qiáng)度，MRP2活性抑制劑MK571可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)

13、的CDF平均熒光強(qiáng)度，證實(shí)MRP2介導(dǎo)CDF的排外。結(jié)果表明烏頭類生物堿可顯著增強(qiáng)MRP2的外排功能。
　　3.5 在Caco-2和LS174T細(xì)胞中，烏頭類生物堿未顯著改變胞內(nèi)Hoechst33342平均熒光強(qiáng)度，但在HepG2細(xì)胞中，烏頭類生物堿顯著降低胞內(nèi)Hoechst33342平均熒光強(qiáng)度，且BCRP活性抑制劑KO143可以顯著增加胞內(nèi)Hoechst33342平均熒光強(qiáng)度，證實(shí)BCRP介導(dǎo)Hoechst33342的排外。結(jié)

14、果表明烏頭類生物堿可顯著增強(qiáng)HepG2細(xì)胞中BCRP的外排功能，對(duì)Caco-2和LS174T細(xì)胞中BCRP的外排功能無顯著影響。
　　結(jié)論:
　　烏頭類生物堿可顯著上調(diào)P-gp的表達(dá)和外排功能，且上調(diào)程度呈現(xiàn)AC＞BAC＞aconine的趨勢(shì);核受體，特別是PXR和CAR受體可能介導(dǎo)烏頭類生物堿對(duì)P-gp的誘導(dǎo)作用;烏頭類生物堿可上調(diào)MRP2和BCRP的表達(dá)和外排功能，且上調(diào)程度呈現(xiàn)AC＜BAC＜aconine的趨勢(shì)，Nrf