聚β-羥基丁酸酯解聚酶發(fā)酵及酶性質研究.pdf

1、聚β-基丁酸酯(PHB)為微生物在不平衡生長條件下于細胞內合成的一類貯藏性聚酯，廣泛存在于自然界原核生物中。因其不僅具有與化學合成高分子相似的性質，而且，其良好的生物相容性、生物降解性、光學活性和壓電性等獨特的性質使得PHB可以作為包裝材料、光學材料和醫(yī)用材料等取代通用的塑料而得到多方面的應用。 本實驗是在對PHB解聚酶降解行為充分研究的基礎上，優(yōu)化發(fā)酵生產和分離純化途徑，對Penicilliumsp.DS9713a菌株產生的胞

2、外聚β-羥基丁酸酯(PHB)解聚酶進行提純，并對其酶學性質及蛋白質學性質進行了初步研究。主要實驗結果如下： 1、以青霉(Penicilliumsp.)，編號DS9713a為實驗菌株，采用傳統(tǒng)搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐發(fā)酵生產胞外PHB解聚酶。產酶高峰分別出現(xiàn)在96h和72h。對發(fā)酵液按以下流程進行分離純化：發(fā)酵液處理--->超濾濃縮(截留分子量5000)--->(NH4)2SO4沉淀除雜(40％飽和度)--->分級透析--->冷凍干燥--

3、->SepharoseCL-6B凝膠色譜。經檢測純化后的PHB解聚酶，純化倍數(shù)為59.1，總酶活回收率為20％。 2、酶蛋白基本性質：采用高效液相色譜對酶蛋白單一性進行檢測，結果顯示樣品純度較好；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為單一譜帶，依據PHB解聚酶的Rm求得其分子量為18000Da；采用連續(xù)聚丙烯酰胺等電聚焦電泳等電點pI為7.6；最適pH為8.6；化學試劑EDTA對PHB解聚酶抑制率最強，SDS，巰基乙醇使酶活損失較大，

4、H2O2，尿素對酶活抑制不明顯。 3、PHB解聚酶蛋白質學研究：Agilentl100型氨基酸自動分析儀分析樣品氨基酸組分，結果顯示，DS9713a菌株所產生的PHB解聚酶除Met外含有15種常見氨基酸，其中天冬氨酸和谷氨酸含量較高，其側鏈基團可能在底物結合或酶的催化反應中起作用；圓二色譜分析顯示酶蛋白二級結構為：Helix：47.5％，Turn：24.3％，Random：28.2％；以PHB為底物，對降解產物進行質譜檢測，結果