利用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建高效產(chǎn)聚γ-谷氨酸菌株.pdf

1、聚γ-谷氨酸(γ-PGA)主要是由一些芽孢桿菌產(chǎn)生的一種水溶性的胞外氨基酸聚合物。近年來(lái)被作為高吸水性材料、增稠劑、藥物載體、生物絮凝劑及重金屬吸附劑等廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化妝品及水處理等領(lǐng)域中，是一種具有極大開(kāi)發(fā)價(jià)值和廣闊應(yīng)用前景的新型多功能高分子材料。本文以枯草芽孢桿菌B53和克氏固氮桿菌N1為出發(fā)菌株，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)對(duì)γ-PGA高產(chǎn)株進(jìn)行了選育研究。主要研究結(jié)果如下： (1)通過(guò)對(duì)親株抗藥性檢測(cè)，確定用四環(huán)

2、素和鏈霉素作為克氏固氮桿菌N1和枯草芽孢桿菌B53的抗性標(biāo)記，即克氏固氮桿菌N1(Tcr，Steps)，枯草芽孢桿菌B53(Tcs，Stepr)。 (2)通過(guò)對(duì)親株原生質(zhì)體制備時(shí)預(yù)處理?xiàng)l件的研究，確定了克氏固氮桿菌N1的預(yù)處理：在培養(yǎng)開(kāi)始加入1.2U/mL的青霉素，繼續(xù)培養(yǎng)8h，0.01mol/LEDTA溶液37℃靜置處理1h；枯草芽孢桿菌B53在培養(yǎng)6h后加入1.2U/mL的青霉素作用4h。 (3)通過(guò)對(duì)兩親株原生質(zhì)體

3、制備和再生條件的研究，確定了兩親株的原生質(zhì)體制備和再生條件：克氏固氮桿菌N1溶菌酶作用濃度為0.2mg/mL，作用時(shí)間為8h，作用溫度為37℃；枯草芽孢桿菌B53的溶菌酶作用濃度為2mg/mL，作用時(shí)間為4h，作用溫度為37℃。 (4)通過(guò)聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)融合法，實(shí)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌B53和克氏固氮桿菌N1之間的融合。通過(guò)對(duì)遺傳穩(wěn)定融合株產(chǎn)γ-PGA能力的比較，選育出γ-PGA產(chǎn)量有較大提高的菌株R8、R11、R36、R44