B型排斥性導向分子在肺癌中的表達與預后研究.pdf

1、腫瘤的轉移和復發(fā)是其惡性表現(xiàn)最基本的特征，同時這也是影響患者預后最主要的因素。近年來，肺癌的發(fā)病率逐年提高，現(xiàn)已經成為最為高發(fā)的腫瘤之一，其也位居腫瘤相關性致死率方面的首位。目前，對于早期的肺癌患者來說，根治性手術切除仍然是首選的治療方式。盡早發(fā)現(xiàn)盡早治療，可以明顯提高患者的預后水平和生活質量。然而，大多數(shù)患者在診斷疾病時已處于中晚期，治療方式主要以放化療手段為主。即便有些患者術后診斷為早期肺癌，但部分仍有可能出現(xiàn)復發(fā)和轉移。當前，由于

2、肺癌早期階段的發(fā)生發(fā)展較為隱匿，同時缺乏特異性的篩查指標和預防措施，有些患者即便接受手術或者放化療，其預后仍然不理想。因此，了解肺癌的發(fā)生發(fā)展機制并進一步探索其生物學特性從而顯得至關重要。
　　B型排斥性導向分子(Repulsive guidance molecules B，RGMB)是排斥性導向分子(RGMs)家族的成員之一。先前已有研究表明在乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌中，RGMB的表達異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關性。但在

3、肺癌中仍少見相關報道。另外，RGMB作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)的共表達受體，其是否會參與并調控BMPs信號通路仍然未知。前期有研究顯示，RGMs可改變腫瘤細胞的惡性生物學行為，抑制其侵襲轉移的能力。本研究的目的旨在研究RGMB在肺癌中的表達情況和其相關的生物學行為。
　　目的：
　　本課題首先通過搜索TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫

4、搜集肺癌組織中RGMB的表達情況，利用統(tǒng)計學方法分析表達的相關性。進一步通過RT-PCR(real-time polymerase chain reaction)檢測了本院120例肺癌組織和30例正常肺組織中RGMB基因的表達情況，分析RGMB基因表達水平與患者臨床指標及疾病預后的相關性。同時，檢測對不同肺癌細胞株進行RGMB基因表達水平的檢測，篩選出高表達的細胞株并構建穩(wěn)定的RGMB基因敲除細胞模型，為下一步驗證其對腫瘤細胞功能的影響

5、和通路研究做進一步準備。
　　方法：
　　1.對TCGA數(shù)據(jù)庫進行分析，研究RGMB表達情況與肺癌的相關性。
　　2.對臨床正常肺組織和肺癌組織標本中RGMB基因的表達量應用熒光定量PCR方法檢測，前瞻性分析RGMB表達水平與臨床病理、分期及預后的關系。
　　3.對高表達RGMB基因的肺癌細胞株進行篩選，使用熒光定量PCR對多種肺癌細胞株進行RGMB mRNA的檢測，從而進一步篩選出RGMB基因處于高表達的肺癌細

6、胞株，為后續(xù)的實驗作進一步準備。
　　4.pLVX-shRNA-Puro-RGMB真核表達載體的構建及其鑒定利用國際上公認的引物設計網站設計及篩選相關序列，交由生物公司進行合成。將所設計的引物與pLVX-Puro質粒重組之后，同時制備感受態(tài)的大腸桿菌，對其進行轉染，對其結果進行陽性克隆的鑒定，并提取質粒;再利用脂質體轉染293T細胞株，對其轉染干擾效率應用熒光定量PCR檢測進行檢測，將高干擾效率片段篩選出后并進行慢病毒包裝和后續(xù)實

7、驗。
　　5.慢病毒LV-RGMB-scramble和LV-RGMB-shRNA的制備，感染A549細胞株
　　在293T細胞中進行慢病毒的包裝、收集及滴度測定，進一步使用該病毒感染篩選出的高表達RGMB的肺癌細胞株A549，利用嘌呤霉素進行穩(wěn)定篩選和培養(yǎng)，從而獲得RGMB基因穩(wěn)定敲除的肺癌細胞株，轉染效率利用mRNA的測定進行判定，分別從蛋白及基因及水平利用western blot法和熒光定量PCR對轉染細胞株中RGMB的

8、表達情況進行檢測。
　　6.沉默RGMB基因對肺癌A549細胞功能的影響
　　利用MTT實驗(methyl thiazolyl tetrazolium test)根據(jù)細胞存活率來描述細胞的生長情況;利用細胞粘附實驗觀察其黏附能力;對細胞的遷移及侵襲能力的測定則利用劃痕實驗、細胞遷移實驗及Transwell侵襲實驗進行觀察。
　　7、利用Western blot對RGMB表達降低的細胞株中BMPs信號通路蛋白分子表達的檢

9、測。
　　結果：
　　1.通過TCGA數(shù)據(jù)庫中肺癌RGMB表達情況的分析得出，RGMB基因在腫瘤組織中下調，并且與T和N分期具有顯著的負相關性。在男性患者中表達較低。
　　2.進一步對本院肺癌標本進行研究，對RGMB的基因表達水平應用RT-PCR進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，肺癌組織中RGMB基因表達水平顯著降低(P＜0.05）。同時，發(fā)現(xiàn)女性患者含有的RGMB表達水平相對較高。肺癌晚期人群RGMB表達水平較低

10、，而早期人群RGMB水平高表達(P＜0.05)。結果提示RGMB高表達與較好的臨床預后和生存狀態(tài)相關。
　　3.成功篩選出了肺癌細胞株A549為高表達RGMB基因的細胞株。并成功構建針對RGMB基因的RNAi真核質粒，經酶切鑒定，將所得的質粒轉染293T細胞后，RT-PCR結果提示該質?？梢援a生理想的干擾效果。
　　4、成功包裝了慢病毒LV-RGMB-scramble、LV-RGMB-shRNA，進一步將其感染A549肺癌細

11、胞株，經嘌呤霉素進行篩選后，結果提示實驗組A549細胞RGMB的mRNA的表達比未處理細胞下降約65％(p＜0.05)。表明已成功構建RGMB基因穩(wěn)定敲除的肺癌細胞株。
　　5、A549RGMB基因穩(wěn)定沉默肺癌細胞株體外增殖能力、黏附、遷移和侵襲能力與對照組相比明顯增強(P＜0.05)。
　　6、為了研究RGMB是否參與BMP的信號通路，利用RGMB穩(wěn)定沉默和對照組A549細胞株進行研究。用Western blot檢測BMP

12、s信號通路中蛋白分子，發(fā)現(xiàn)RGMB沉默后Smad-1/5/8磷酸化水平上升(p＜0.05);然而ERK和JNK蛋白的活化水平兩組間未見明顯改變。該結果認為RGMB可能是通過抑制Smad1/5/8通路來發(fā)揮抑制腫瘤的作用。
　　結論：
　　1、成功構建了針對RGMB基因的慢病毒干擾載體，對肺癌細胞A549中RGMB基因的表達狀態(tài)可持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)揮抑制作用。
　　2、沉默RGMB基因的表達能夠促進肺癌細胞的生長、侵襲和轉移等