同源重組技術(shù)在釀酒酵母表達(dá)載體構(gòu)建中的應(yīng)用.pdf

1、釀酒酵母系統(tǒng)是最重要的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一。釀酒酵母存在高效的同源重組機(jī)制，兩個(gè)DNA分子間只要有30-50bp長的同源區(qū)段就可以準(zhǔn)確、有效地進(jìn)行同源重組。本論文旨在利用同源重組技術(shù)構(gòu)建兩類新型釀酒酵母表達(dá)載體——不含大腸桿菌質(zhì)粒序列、穩(wěn)定性高的pHR系列表達(dá)載體和適合小分子多肽與人超氧化物歧化酶融合表達(dá)的載體pRSODF。為了構(gòu)建不含大腸桿菌抗藥性質(zhì)粒序列，具有高穩(wěn)定性的pHR系列表達(dá)載體，我們先在載體pHC11的基礎(chǔ)上構(gòu)建了載體pH

2、C11R，然后以人α2b干擾素基因和乙肝病毒融合抗原基因SA28為試驗(yàn)基因，通過PCR擴(kuò)增這兩個(gè)基因的表達(dá)單元，并在它的兩端引入同源重組所需的序列，將它們分別與pHC11R去除大腸桿菌質(zhì)粒序列的DNA片段共轉(zhuǎn)化釀酒酵母DCO4，得到表達(dá)人α2b干擾素和表達(dá)乙肝病毒融合抗原SA28的工程菌：DCO4/pHC11R-IFNα2b和DCO4/pHC11R-SA28。為了使構(gòu)建的載體能適應(yīng)不同類型的外源基因的表達(dá)需要，本文還進(jìn)一步構(gòu)建了pHR系

3、列載體。根據(jù)人胰島素原與人SOD融合可以在釀酒酵母中獲得高效表達(dá)的文獻(xiàn)報(bào)道，本文以我們先期構(gòu)建的含有人SOD表達(dá)單元的質(zhì)粒F2-hSOD為基礎(chǔ)，建成了可以用同源重組構(gòu)建小分子多肽與人SOD融合表達(dá)的載體pRSODF。在構(gòu)建時(shí)還在小分子多肽與人SOD的連接區(qū)插入腸激酶識(shí)別位點(diǎn)，這樣可以使小分子多肽能從融合蛋白中切割下來。為了驗(yàn)證這個(gè)載體在實(shí)際應(yīng)用中的可行性，一個(gè)編碼28個(gè)氨基酸的胸腺肽α1基因被用做試驗(yàn)基因。通過PCR擴(kuò)增胸腺肽α1基因，