一種高效構(gòu)建LIC表達(dá)載體的方法和一種高效構(gòu)建RNA干擾載體的方法.pdf

1、人類基因組測(cè)序計(jì)劃的完成推動(dòng)了生物學(xué)研究向后基因組時(shí)代的邁進(jìn)。大量的基因信息迫切要求發(fā)展適合于高通量、自動(dòng)化的研究基因功能的方法。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的重要產(chǎn)物之一，是生命活動(dòng)的主體，因此研究蛋白質(zhì)的功能具有重大意義。近年來，RNA干擾技術(shù)被證明是有效闡明基因功能的有力工具。本研究著眼于發(fā)展新的構(gòu)建LIC載體的方法，以用于高通量蛋白質(zhì)表達(dá)純化；另外，還提出了新的構(gòu)建RNA干擾載體的方法，使其能有效的用于基因功能研究。 本研究中提出

2、了一種新的產(chǎn)生不依賴連接酶(Ligation-independent cloning，LIC)的表達(dá)載體的方法，并將此LIC載體用來表達(dá)產(chǎn)生不帶有任何額外氨基酸的天然蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中，LIC載體經(jīng)缺刻酶N．BbvC IA和限制性內(nèi)切酶SwaI依次酶切，產(chǎn)生兩個(gè)帶有固定堿基的一定長(zhǎng)度的單鏈粘性末端；相應(yīng)的目的基因的PCR片段在dGTP存在的條件下用T4 DNA聚合酶處理，生成與載體相匹配的粘性末端。處理后的載體和片段體外溫育，退火，轉(zhuǎn)化大

3、腸桿菌后分子間的缺刻被修復(fù)，形成完整的重組質(zhì)粒。另外，在載體上編碼親和標(biāo)簽和靶蛋白的序列之間設(shè)計(jì)有一TEV蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。得到的重組質(zhì)粒能用來表達(dá)融合有His<,6>-tag或His<,6>-GST的重組蛋白，純化的融合蛋白經(jīng)體外TEV蛋白酶酶切后能有效的出去標(biāo)簽，得到不含任何外源氨基酸的天然蛋白。此方法不僅使用于單個(gè)目的蛋白的表達(dá)純化，也能有效的用于蛋白質(zhì)組的研究。 另一方面，本研究提出了一種新的方法來構(gòu)建RNA干擾載體，即