草魚腸道組織cDNA文庫構(gòu)建及部分ESTs分析.pdf

1、草魚是我國特有的具有巨大經(jīng)濟價值的鯉科大型魚類，產(chǎn)量產(chǎn)值均位居我國淡水養(yǎng)殖魚類第一。同時，草魚也是能高效轉(zhuǎn)化植物成為優(yōu)質(zhì)動物蛋白的魚種，被譽為"水中牛羊"，研究草魚腸道消化代謝功能基因相關(guān)特性將使我們從分子生物學水平上更客觀、更精確地了解草魚的營養(yǎng)消化機理和特性，本文采用雌性草魚腸道為實驗材料，采用非均一化的Oligo-dT引物定向克隆技術(shù)構(gòu)建了草魚腸道組織的cDNA文庫，結(jié)合目前廣泛應用于基因功能和表達模式的分析研究的EST測序分析技

2、術(shù)，對具有時空性和組織特異性表達等功能基因特征進行了聚類分析，并且同GenBank等數(shù)據(jù)庫進行比對、查詢和注釋。結(jié)果顯示418條序列有相關(guān)同源性，其他的521(55.5％)條序列沒有明顯的同源性(E-value≥1.00E-10)，揭示出在這些ESTs中能夠發(fā)現(xiàn)新功能基因的相當可能性。 利用TRlzol法抽提草魚腸道組織總RNA，經(jīng)過親和素順磁磁珠(SA-PMPS)法從總RNA中分離純化富含Poly(A)的mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成d

3、s cDNA，連接EcoR Ⅰ接頭，末端磷酸化，Xho Ⅰ消化，將雙末端黏性化的雙鏈ds cDNA經(jīng)過膠回收cDNA片段篩選收集大于500 bp的cDNA片段，加工后與pBluescript Ⅱ SK(+)Vector連接，經(jīng)電轉(zhuǎn)化入DH10B宿主菌，構(gòu)建cDNA.文庫，挑取陽性克隆，做PCR檢測，然后根據(jù)電泳圖粗略鑒定插入片斷的大小及小片段率；將合格的cDNA文庫送檢。檢測文庫庫容量至少為2.3×10<'5>，重組率達95％，平均插入

4、片斷長度大于1000 bp。大規(guī)模EST測序主要包括模板制備、測序反應、序列識別等流程。模板制備采用半自動化流水線方式，主要步驟包括：文庫鋪板培養(yǎng)，大量隨機挑取菌落(cDNA克隆)，細菌增殖，質(zhì)粒DNA提取，電泳鑒定等。測序及序列初步分析工作主要在北京華大基因研究中心完成。結(jié)果共進行了1571個成功反應，其中1411條ESTs長度大于100bp，使用Cross-match軟件去掉EST中的低質(zhì)量序列、載體序列、重復序列等，使用Phrap

5、序列拼接軟件將測序得到的EST拼接成重疊群，初步拼接得到939個單基因簇(Unigene)，其中包括188個重疊群(Contigs)，751個單拷貝EST(Singletons)。將拼接得到的重疊群和單拷貝EST與GenBank非冗余蛋白庫比對并使用GO(Gene Ontology)分類的方法做功能注釋。GO分類是現(xiàn)在較常用的EST分類方法，除此之外，還進行GC含量、密碼子使用頻率等分析。418個重疊群和單拷貝的ESTs中有195個可歸

6、屬于細胞組分(Cellular component)、分子功能(Molecular function)和生物學過程(Biological processs)三個大類，而其余223個重疊群和單拷貝EST則為未知功能的EST。絕大部分EST與營養(yǎng)代謝、生理學過程、細胞結(jié)構(gòu)、酶活性及細胞過程有關(guān)，少數(shù)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、信號傳導活性以及細胞分裂分化等功能有關(guān)。本研究結(jié)果對草魚以及其他鯉科魚類的消化系統(tǒng)功能基因的篩選和發(fā)現(xiàn)具有指導意義。此外，草魚腸