綠色木霉LTR-2β-1，3-葡聚糖酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、綠色木霉，是一種普遍存在的絲狀真菌，在自然界分布廣泛，在植物病害生物防治領(lǐng)域占有重要地位.其中的很多菌株都可以產(chǎn)生多種細(xì)胞壁裂解酶，主要是β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶.在重復(fù)寄生過(guò)程中，依靠細(xì)胞壁裂解酶攻擊植物病原真菌的細(xì)胞壁. β-1，3-葡聚糖酶可以催化β-1，3-葡聚糖的水解反應(yīng)，而很多植物的病原真菌細(xì)胞壁的主要成份都含有β-1，3-葡聚糖，因此，β-1，3-葡聚糖酶是抗植物真菌病害的重要物質(zhì)之一. 本文采用PC

2、R的方法以綠色木霉LTR-2的cDNA為模板，擴(kuò)增得到β-1，3-葡聚糖酶基因(glu)，克隆至載體pMD18-T上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-T-glu.對(duì)pMD18-T-glu上插入的β-1，3-葡聚糖酶基因外源片段進(jìn)行了測(cè)序和序列分析.測(cè)序結(jié)果表明:綠色木霉LTR-2的β-1，3-葡聚糖酶編碼基因由2289個(gè)核苷酸殘基組成，編碼762個(gè)氨基酸，與報(bào)道基本相同.將該序列提交NCBI GenBank，獲得編號(hào)為EF176582.

3、 將β-1，3-葡聚糖酶基因從重組質(zhì)粒pMD18-T-glu酶切后，連接到畢赤酵母穿梭載體pPIC9K上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC9K-glu.采用PEGl000的方法轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71得到重組轉(zhuǎn)化子，PCR擴(kuò)增證實(shí)了β-1，3-葡聚糖酶基因已整合到酵母的基因組中.SDS-PAGE分析和表達(dá)產(chǎn)物的酶活性研究證明，β-1，3-葡聚糖酶能有效分泌和高效表達(dá)，培養(yǎng)液中酶活達(dá)到889U/mL，比原始菌株LTR-2提高了3.76倍，表達(dá)產(chǎn)物具有