無(wú)選擇標(biāo)記抗晚疫病轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的獲得.pdf

1、馬鈴薯是全球第三大重要農(nóng)作物，僅次于小麥和玉米。由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的晚疫病，是導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)最嚴(yán)重的病害之一，在世界上絕大多數(shù)馬鈴薯的栽培地區(qū)廣泛傳播。采用傳統(tǒng)育種、化學(xué)農(nóng)藥等方法來(lái)防治馬鈴薯晚疫病雖然早有研究，但至今收效甚微。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的興起為晚疫病的防治提供了新的鍥機(jī)。本實(shí)驗(yàn)采用生物安全的轉(zhuǎn)基因方法，將抗晚疫病基因R1、RB、R3a轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培品種 Desiree，獲得生物安全的抗晚疫

2、病轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。研究?jī)?nèi)容如下：
　　1)無(wú)標(biāo)記載體 pMF-LIC構(gòu)建。以引物 OXN037/OXN038對(duì)質(zhì)粒 pJG100進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得LIC序列的片段，膠回收后與質(zhì)粒pMF-GUS分別進(jìn)行XbaⅠ/SacⅠ雙酶切，回收片段用 T4 DNA連接酶連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DB3.1，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒PCR和質(zhì)粒XbaⅠ/SacⅠ雙酶切及SacⅠ單酶切鑒定，成功構(gòu)建了無(wú)標(biāo)記植物表達(dá)載體pMF-LIC。
　　2)抗晚

3、疫病基因克隆到無(wú)標(biāo)記載體上。分別用引物 OXN045/OXN046、OXN051/OXN052、0XN093/OXN096從質(zhì)粒 pBINPLUS-R3a、pCLD04541-R1、pCLD04541-RB上PCR擴(kuò)增出抗晚疫病基因R3a、R1、RB，同時(shí)用Apa I酶切載體pMF-LIC。用不依賴(lài)于連接反應(yīng)的克隆（LIC）方法將抗晚疫病基因 R3a、R1、RB分別克隆到無(wú)標(biāo)記植物表達(dá)載體pMF-LIC上，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，

4、經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒 PCR、質(zhì)粒 XbaⅠ/SacⅠ雙酶切及 SacⅠ單酶切驗(yàn)證重組載體 pMF-R1/RB/R3a構(gòu)建成功。
　　3)抗晚疫病基因工程農(nóng)桿菌獲得。通過(guò)三親融合，在幫助菌 HB101的幫助下將重組載體pMF-R1/RB/R3a轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL0中，經(jīng)過(guò)菌落PCR、質(zhì)粒PCR、質(zhì)粒XbaⅠ/SacⅠ雙酶切及 SacⅠ單酶切鑒定，成功構(gòu)建工程農(nóng)桿菌 AGL0-pMF-R1/RB/R3a。
　　4)無(wú)選擇標(biāo)記抗晚疫