線粒體自噬在肝纖維化中的作用.pdf

1、肝纖維化（Liver fibrosis）是多種肝臟疾病共同的病理過程，其中一部分會(huì)進(jìn)展為肝硬化和/或肝癌，死亡率高，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅人類健康。肝纖維化是一種可逆性的損傷-修復(fù)過程，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積是促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展的重要因素，而細(xì)胞外基質(zhì)主要來源于肝星狀細(xì)胞（HSCs），因此抑制HSCs的活化是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵。線粒體是生產(chǎn)能量的主要場(chǎng)所，參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)，因此，線粒體穩(wěn)態(tài)對(duì)維持正常的細(xì)胞功能至關(guān)重要。線粒體自噬由Le

2、masters于2005年首次提出，主要指通過自噬的方式降解細(xì)胞內(nèi)損傷或多余的線粒體，維持線粒體數(shù)量及質(zhì)量的穩(wěn)定，從而維持正常的細(xì)胞功能。研究顯示，白藜蘆醇可誘導(dǎo)HSCs發(fā)生線粒體自噬，表明HSCs中存在線粒體自噬現(xiàn)象。但線粒體自噬與肝纖維化之間的關(guān)系，目前尚無報(bào)道。本研究以C57BL/6雄性小鼠及人HSCs細(xì)胞株LX-2為研究對(duì)象，建立肝纖維化模型，從動(dòng)物及細(xì)胞層面進(jìn)行研究，探討線粒體自噬在肝纖維化中的作用。
　　目的：探討線粒

3、體自噬在肝纖維化中的作用，為肝纖維化的治療提供新思路。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射CCl4建立小鼠肝纖維化模型并用TGF-β刺激LX-2細(xì)胞活化，分別在體內(nèi)及體外觀察肝纖維化形成及HSCs活化過程中線粒體自噬的變化。應(yīng)用線粒體自噬抑制劑CyclosporineA及誘導(dǎo)劑Valinomycin驗(yàn)證線粒體自噬與肝纖維化及HSCs活化之間的關(guān)系。通過檢測(cè)血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase, ALT

4、）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate transaminase, AST）的水平及肝臟組織HE染色來觀察肝臟炎癥程度；通過天狼星紅染色觀察膠原變化，通過免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry, IHC）分析α-SMA的表達(dá)。用蛋白免疫印跡法（Westen blotting, WB）分析α-SMA、Collagen I、HSP60、TOM20、PINK1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴腹腔注射橄欖油（oil）后6W

5、及注射CCl4后2W、4W和6W，分別留取小鼠血清及肝臟組織，并進(jìn)行HE、天狼猩紅及IHC染色。結(jié)果顯示與oil組相比，CCl4組血清ALT及AST水平隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高；HE染色顯示 CCl4組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞脂肪變性及壞死嚴(yán)重，6 W時(shí)達(dá)到高峰；天狼星紅染色及WB顯示CCl4組膠原纖維隨注射時(shí)間延長(zhǎng)而增加，6 W時(shí)達(dá)到高峰；IHC及WB顯示CCl4組α-SMA表達(dá)隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)增加；上述結(jié)果證實(shí)肝纖維化造模成功。W

6、B顯示在CCl4組中，代表線粒體剩余量的 TOM20及 HSP60表達(dá)顯著增加，表明肝纖維化過程中線粒體自噬被抑制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用不同濃度梯度及時(shí)間梯度的TGF-β刺激HSCs活化，WB結(jié)果顯示HSCs活化指標(biāo)α-SMA及Collagen I表達(dá)增加，線粒體剩余量指標(biāo)TOM20、HSP60表達(dá)增加，線粒體自噬相關(guān)蛋白 PINK1表達(dá)減少，并且各指標(biāo)變化呈濃度依賴性及時(shí)間依賴性，表明HSCs活化過程中，線粒體自噬減弱。⑵動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與單

7、獨(dú)應(yīng)用CCl4組相比，應(yīng)用線粒體自噬抑制劑 CsA后，小鼠肝臟TOM20及HSP60的表達(dá)增加，證明CsA能夠抑制線粒體自噬。應(yīng)用CsA后，與單獨(dú)應(yīng)用CCl4組相比，小鼠血清ALT、AST水平更高，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂程度、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞脂肪變及壞死程度更重，膠原沉積更加明顯、α-SMA表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，表明線粒體自噬抑制劑CsA可促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與單純TGF-β刺激組比較，應(yīng)用線粒體自噬抑制劑后，線粒體剩余量標(biāo)志TOM20、

8、HSP60表達(dá)增加，線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1表達(dá)減少，肝纖維化指標(biāo)α-SMA及Collagen I表達(dá)增加，表明抑制線粒體自噬可促進(jìn)HSCs的活化。⑶WB結(jié)果顯示，與單純TGF-β組比較，應(yīng)用線粒體自噬誘導(dǎo)劑后，線粒體剩余量標(biāo)志TOM20、HSP60減少，線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1表達(dá)增加，HSCs活化指標(biāo)α-SMA及Collagen I表達(dá)減少，結(jié)果提示誘導(dǎo)線粒體自噬能夠抑制HSCs活化。
　　結(jié)論：在肝纖維化形成及HSC