昆白小鼠胚胎干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、昆白小鼠是我國最常用的實驗動物之一，但已經(jīng)建立的小鼠ES細胞系大多來源于129、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠，而用昆白小鼠建系的報道很少。因此建立昆白小鼠細胞ES系對我國深入而便利地開展干細胞的研究具有重要意義。 本研究從昆白小鼠胚胎中分離克隆出小鼠ES細胞，并對其進行了傳代培養(yǎng)和鑒定，對影響小鼠ES細胞分離克隆的一些因素進行了探討，目的在于篩選出更適合昆白小鼠ES細胞的分離克隆體系，為進一步建立昆白小鼠ES細胞系奠

2、定基礎(chǔ)，實驗主要結(jié)果如下： 1.從446枚昆白小鼠胚胎中分離培養(yǎng)ES細胞，323枚ICM長出，ICM形成率為72.4％；并從72枚ICM中得到ES細胞，ES細胞的形成率為16.1％，最高所傳代數(shù)為5代。 2.比較了不同的飼養(yǎng)層對昆白小鼠ES細胞分離克隆的影響：分別以MEF、STO、經(jīng)絲裂霉素C處理后冷凍再解凍的STO和PEF作為飼養(yǎng)層；在這4種飼養(yǎng)層上，胚胎的孵化率和ICM形成率差異不顯著；但在原代集落形成率和傳代次數(shù)上

3、差異顯著(p＜0.05)：MEF的效果最好，STO、經(jīng)絲裂霉素C處理后冷凍再解凍的STO次之，PEF最差。 3.利用BRL-CM作為培養(yǎng)液培養(yǎng)昆白小鼠的胚胎和ES細胞，胚胎可正常貼壁，ICM也可正常長出；將ICM分離接種有飼養(yǎng)層和無飼養(yǎng)層的條件中，只有條件培養(yǎng)基BRL-CM和飼養(yǎng)層相互結(jié)合時，才能促進昆白小鼠的ES細胞增殖并維持早期傳代而保持不分化狀態(tài)，這說明昆白小鼠ES細胞分離培養(yǎng)過程中，BRL-CM還不能完全替代飼養(yǎng)層的作用

4、。 4.比較了不同的傳代方法對昆白小鼠ES細胞分離克隆的影響：分別用0.25％的Trypsin-EDTA和2.4U/mL的Diapase作為消化液以酶消化法，用0.10％的Trypsin-EDTA和2.4U/mL的Diapase作為消化液以酶消化法+機械剝離來傳代ES細胞；0.25％的Trypsin-EDTA對細胞的損傷較大，不適合昆白ES細胞的傳代，其他3種方法均適合昆白ES細胞的傳代。 5.對分離得到的ES細胞進行了