抗菌肽Cecropin B-人溶菌酶融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、分離純化及檢測(cè).pdf

1、抗菌肽(anti-bacterial peptides，簡(jiǎn)稱ABP)是生物細(xì)胞特定基因編碼產(chǎn)生的一類(lèi)小分子多肽，是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障，其生成和釋放是機(jī)體炎癥反應(yīng)的組成部分?？咕牟粌H對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌具有高效廣譜的殺滅能力，而且對(duì)某些病毒、真菌和原蟲(chóng)也具有抑殺作用；同時(shí)它對(duì)一些腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，但對(duì)正常哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞卻無(wú)明顯的毒副作用。人溶菌酶(human lysozyme)是人體內(nèi)的一種蛋

2、白質(zhì)，具有抗革蘭氏陰性細(xì)菌和抗一些病毒的能力，和人體具有天然相容性。在臨床上應(yīng)用時(shí)，它比其它溶菌酶更安全，沒(méi)有刺激性和副作用。本實(shí)驗(yàn)的目的是在構(gòu)建好的抗菌肽CecropinB-人溶菌酶融合蛋白工程菌的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白，并對(duì)其進(jìn)行分離、純化以及活性測(cè)定，以期尋找出有利于CB-hLy表達(dá)的條件，及有效的純化途徑，從而得到一種具有更高活性的抗菌和抗病毒的重組蛋白。 抗菌肽和溶菌酶均具有很強(qiáng)且廣譜的抗抑菌活性，這一特性為其基

3、因工程操作帶來(lái)諸多不便。我們采用BL21(DE3)pLysS為宿主菌，并且將重組蛋白CB-hLV的表達(dá)視為兩個(gè)階段，前一個(gè)階段為質(zhì)粒生長(zhǎng)階段，采用37℃培養(yǎng)菌體，主要是保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性和提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)；后一個(gè)階段為重組蛋白表達(dá)階段，待菌體生長(zhǎng)飽和后，在25℃下低溫誘導(dǎo)重組蛋白CB-hLy的表達(dá)。我們除了對(duì)溫度進(jìn)行考察外，還研究了培養(yǎng)基、誘導(dǎo)時(shí)間等因素對(duì)蛋白表達(dá)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在TB培養(yǎng)基中，菌體先在37℃下生長(zhǎng)至飽和后，再更換

4、相同體積的新鮮TB培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)到25℃下低溫誘導(dǎo)4h，上清中的蛋白表達(dá)量就可接近409％。由于目的蛋白帶有6xHis標(biāo)簽，因此可采用鎳離子金屬螯合層析對(duì)其進(jìn)行第一步純化，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)分析表明，其純度約為85％，蛋白得率為1.57％。再經(jīng)第二步凝膠排阻柱層析分離后得到目的蛋白純度約為94％，蛋白得率為0.49％。采用瓊脂滲透法對(duì)得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行生物活性分析，結(jié)果表明純化產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌有良好