三種蠕形螨的形態(tài)學(xué)和RAPD研究.pdf

1、目的: 應(yīng)用環(huán)境掃描電子顯微鏡(environmental scanningelectronmicroscope，ESEM)技術(shù)觀察兩種人體蠕形螨的超微結(jié)構(gòu)，同時與普通掃描電鏡掃描的山羊蠕形螨超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，做出形態(tài)學(xué)分類。用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)技術(shù)確定三種蠕形螨的分類地位，進(jìn)行條帶分析并計算不同類蠕形螨的遺傳距離。判斷三者的親緣關(guān)系并與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類做比較。 方法: 加壓刮取人額部皮脂，切開新鮮山

2、羊皮下結(jié)節(jié)，將獲得物置于滴有2﹪洗潔精溶液的載玻片上，在解剖鏡直視下，用自制挑螨針將毛囊蠕形螨、皮脂蠕形螨和山羊蠕形螨從皮脂中分離并清洗干凈。 將潔凈活螨按觀察部位的要求，在解剖鏡下擺上電鏡樣品托，立即掃描，拍攝照片。環(huán)境掃描電鏡工作參數(shù)：工作距離(WD) 7.5-9.3mm、高電壓(HV)20.0KV、高真空探頭(Det)GSED、束斑(Spot) 3.0、溫度5℃、壓力0.5 kpa、相對濕度60﹪。 將潔凈新鮮的三

3、種蠕形螨分別在解剖鏡直視下，于自制微型研缽中研磨粉碎。用改進(jìn)的小型昆蟲基因組提取方法，分別提取三種蠕形螨的基因組DNA，摸索聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)總體積、反應(yīng)條件。選取12條不同的隨機(jī)排列堿基順序的多聚核苷酸單鏈為引物，進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳，制備DNA多態(tài)性圖譜，比較三種蠕形螨基因組DNA多態(tài)性，分析三種蠕形螨兩兩間的遺傳距離，從DNA水平鑒定這三種蠕形螨。 結(jié)果: 經(jīng)過掃描電鏡觀察，發(fā)

4、現(xiàn)三種蠕形螨在背基刺形狀及相對位置、口器形狀、須爪數(shù)目和排列等超微結(jié)構(gòu)上，均有明顯的差異；足體上，三種蠕形螨的背部皮紋、背足體毛、足節(jié)形狀及爪、爪距、股距、雄性生殖孔及陰莖形狀、雌性陰門形狀都不相同；末體的形狀和紋形也不相同。 經(jīng)過RAPD電泳條帶分析，篩選出5個擴(kuò)增產(chǎn)物較多、譜帶清晰、多態(tài)性較好的引物，用這5個引物共擴(kuò)增出49條條帶，片段大小范圍為250-2500bp。其中山羊蠕形螨共有17個多態(tài)性片段，皮脂蠕形螨共有9個多態(tài)

5、性片段，毛囊蠕形螨有23個多態(tài)性片段。山羊蠕形螨與毛囊蠕形螨有5條共享條帶。山羊蠕形螨與皮脂蠕形螨有4條共享條帶。毛囊蠕形螨與皮脂蠕形螨間僅有1條共享條帶。根據(jù)獲得的條帶進(jìn)行遺傳距離分析，毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨兩個種間的平均遺傳距離(D1)為0．9375，毛囊蠕形螨和山羊蠕形螨之間的平均遺傳距離(D2)為0．8500，皮脂蠕形螨和山羊蠕形螨之間的平均遺傳距離(D3)0．6923。D l和D2均大于D3。 結(jié)論: 三種蠕形